纖維原樣蛋白2陽性表達預測急性胰腺炎病情的嚴重程度

懷佳萍 葉曉華 蔡振寨 陳燕萍

有學者認為，凝血機制的異常和血栓形成在重癥急性胰腺炎(SAP)發病機制中占重要地位[1]，它最終可發展成彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[2]。纖維原樣蛋白2(Fgl2)是一種新型的纖維蛋白原，表達于各種類型的細胞，在血栓的形成中發揮重要作用。它能激活凝血酶原酶，繼而激發凝血系統，最終形成血栓，導致微循環障礙[3]。但Fgl2在SAP發病機制中的作用尚不清楚。本研究檢測急性胰腺炎(AP)患者外周血單核細胞和胰腺組織中Fg12的表達，探討其評估AP嚴重程度的臨床應用價值。

一、材料和方法

1．標本收集：收集12例SAP、6例輕癥急性胰腺炎(MAP)患者外周血，分離單個核細胞(PBMC)，以8名健康志愿者的PBMC作為對照。SAP及MAP的診斷符合中華醫學會消化病分會胰腺病學組制定的標準。另收集2003年至2011年間15例行手術治療的SAP患者的胰腺組織及11例胰腺癌手術時取的癌周胰腺組織，經病理檢查證實為MAP的石蠟切片。

2．實時定量PCR：取分離得到的PBMC，應用Trizol抽提細胞總RNA，并逆轉錄成cDNA。引物序列： Fgl2上游為5′-CCTGGAGATTGTGGTTTCGT-3′，下游為5′-TACCATGCCTTTCTCCAAGG-3′； 內參β-actin上游為5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′，下游為5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。 PCR反應條件：95℃ 15 s，60℃ 45 s， 72℃ 60 s，40次循環。根據反應曲線計算Ct值(Threshold Cycle)，采用公式2-ΔΔCt計算目的基因mRNA相對表達量。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

3．免疫組化：采用Envision試劑盒檢測外周單核細胞和胰腺組織的Fgl2表達。兔抗大鼠Fgl2多抗工作濃度為1∶100，最后DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。在200倍光鏡下隨機選取10個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件測定其平均吸光度值，并進行半定量分析。

二、結果

1．外周血單核細胞Fgl2 mRNA及蛋白的表達：SAP組、MAP組、對照組PBMC的Fg12 mRNA相對表達量分別為2.13±1.00、1.02±0.36、1.00±0.08。SAP組PBMC的Fg12 mRNA表達顯著高于MAP組及對照組，差異具有統計學意義(P值均<0.01)，而MAP組與對照組的差異無統計學意義。SAP組、MAP組、對照組的Fg12蛋白的相對表達量分別為1.65±0.91、0.87±0.54、0.79±0.1，SAP組PBMC的Fg12蛋白表達顯著高于MAP組和對照組，差異有統計學意義(P值均<0.01)，而MAP組和對照組之間的差異無統計學意義(圖1)。

圖1 SAP組(a)、MAP組(b)、對照組(c)PBMC的Fgl2蛋白表達(免疫組化 ×200，)

2．胰腺組織Fgl2蛋白表達：SAP患者胰腺組織Fgl2高表達，主要表達于間質細胞和血管內皮細胞，MAP患者胰腺組織無明顯Fgl2表達(圖2)。SAP組、MAP組、對照組胰腺組織Fg12蛋白的相對表達量分別為2.19±1.12、0.71±0.43、0.86±0.19。SAP組胰腺組織Fg12蛋白表達量顯著高于MAP組和對照組，差異有統計學意義(P值均<0.01)，而MAP組和對照組之間的差異無統計學意義。

圖2 SAP組(a)、MAP組(b)胰腺組織Fgl2蛋白的表達(免疫組化×200，)

3．Fgl2表達與Ranson、APACHEⅡ評分的相關性：SAP患者的Ranson、APACHEⅡ評分分別為(3.64±1.19)、(10.88±2.28)分，MAP患者為(1.54 ±0.61)、(6.86±1.60)分，SAP患者較MAP患者顯著升高，差異具有統計學意義(P值均<0.001)。SAP患者胰腺組織Fgl2表達量與SAP患者的Ranson、APACHEⅡ評分均呈正相關(r值分別為0.937、0.976,P值均<0.01)。

討論SAP為一種炎癥性疾病，在炎癥過程中，纖維蛋白沉積導致的微血栓形成對病情的發展起重要作用[4]。Fgl2是一種新的促凝劑，能夠通過其替代途徑直接將凝血酶原轉化為凝血酶，促進微血栓的形成[5]。 Fgl2主要表達于活化的巨噬細胞、T細胞和內皮細胞。

Fgl2啟動的凝血途徑是通過“免疫凝血”來實現的，表達于微血管內皮細胞、巨噬細胞和其他一些免疫細胞的Fgl2是由一系列促炎因子所介導的[6]。Clark等[7]報道，在TNF-α刺激下，滋養層和蛻膜層大量表達Fgl2，結果誘導CBA×DBA/2小鼠流產。

本研究結果顯示，SAP組患者PBMC的Fg12 mRNA及蛋白的表達較MAP組和對照組顯著上調，且主要定位于胰腺炎癥區域所浸潤的間質細胞和微脈管系統的內皮細胞。文獻報道，Fgl2定位與纖維蛋白(原)的定位一致，表明Fgl2的表達可引起纖維蛋白沉積，導致微血栓形成，進而導致胰腺的病理損傷。雖然本研究采用的MAP組織是胰腺癌周圍的胰腺組織，但Su等[6]報道肝癌組織及間質細胞均表達FgI2蛋白，故MAP組織未表達FgI2蛋白可排除假陰性的可能性。

通過spearman相關分析，PBMC的Fgl2表達與SAP患者入院24 h內Ranson、APACHEⅡ評分呈正相關，因此，檢測PBMC的Fgl2的表達可能具有早期監測SAP嚴重程度的臨床價值。此外，抗Fgl2抗體治療或抗Fgl2基因療法的有效性在MHC-3肝炎、移植排斥中也已得到證實[8]，可以減輕纖維蛋白的沉積和病理損傷，從而為胰腺炎的治療提供新的靶點。

參 考 文 獻

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