一種抗真菌抗生素發(fā)酵工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究

朱海東+謝萍華+黃通新+

摘要：鏡檢觀察菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)，用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法確定菌株最佳發(fā)酵條件。結(jié)果表明，該菌株與鏈霉菌形態(tài)類似，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，最佳發(fā)酵條件為葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍL／２５０ ｍL，發(fā)酵時(shí)間７２ ｈ。所產(chǎn)抗生素對(duì)高溫（９５ ℃）具有較高的穩(wěn)定性，在酸性和中性環(huán)境中比較穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：菌株；抗真菌抗生素；發(fā)酵工藝

中圖分類號(hào)：ＴＱ４６５．２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）09－2050-02

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ

Ａ Ｋｉｎｄ ｏｆ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ

ZHU Hai-dong，XIE Ping-hua，HUANG Tong-xin

(Hangzhou Vocational and Technical College，Hangzhou 310018，China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ： The colony and cell morphology of one strain was observed with microscopy. The orthogonal experiment was conducted to confirm the optimal fermentation conditions. The results showed that this strain was similar to Streptomyces on morphology. G+and the optimal fermentation conditions were glucose 15 g/L，yeast powder 40 g/L, loaded liquid 30 ml/250ml， fermentation time 72 h. The antibiotics produced by the actinomyces strain were highly stable in hot temperature（95 ℃）， acidic or neutral environment.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： bacterial straim； antifungal antibiotic； fermentation process

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步提高了重癥病人的生存幾率，然而由于這些病人的抵抗力較差，易發(fā)生條件致病真菌引起的深部感染［１－４］。本研究從土壤中篩選到一株放線菌Actinormyces Ｓ１，前期試驗(yàn)證明該菌株的代謝產(chǎn)物能對(duì)部分導(dǎo)致深部真菌感染的微生物具有較好的抑制作用。本研究通過試驗(yàn)了解該菌株的基本生長(zhǎng)特點(diǎn)，運(yùn)用正交試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，并對(duì)該抗生素粗提物的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為后續(xù)對(duì)該菌株的進(jìn)一步深入研究打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

１．１．１試驗(yàn)菌株由杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物制藥研究所提供。

１．１．２主要培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉２５ ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．４ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４·７Ｈ２Ｏ １ ｇ、蛋白胨１ ｇ、瓊脂２０ ｇ、１０％土豆汁１ Ｌ（小塊狀土豆１００ ｇ，１ Ｌ水煮沸１ ｈ后過濾定容１ Ｌ，１２１ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ）；平板培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：高氏一號(hào)培養(yǎng)基［５］；指示菌培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖４０、蛋白胨１０、瓊脂２０, ｐＨ ５．６, １１５ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ；種子培養(yǎng)基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１５、硫酸鎂０．５、蛋白胨５、磷酸氫二鉀１、硫酸亞鐵０．０１、碳酸鈣０．４, ｐＨ自然，１２１ ℃蒸汽滅菌２０ ｍｉｎ；原始發(fā)酵培養(yǎng)基組成（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０、酵母粉３０、蛋白胨５、磷酸氫二鉀１、氯化鈉１、碳酸鈣１、接種量為１０％，培養(yǎng)基ｐＨ為６．５，裝液量５０ ｍＬ／２５０ｍＬ三角瓶。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１菌株生長(zhǎng)過程觀察將菌株接種至斜面培養(yǎng)基上，恒溫３０ ℃培養(yǎng)，當(dāng)菌株生長(zhǎng)至２、３、４、５、６ ｄ時(shí)，觀察菌落特征，并用印片染色法［６］觀察菌株形態(tài)，用Ｍｏｔｉｃ數(shù)碼顯微鏡觀察，拍攝并記錄其生長(zhǎng)過程。

１．２．２發(fā)酵液中抗生素效價(jià)測(cè)定取１０ ｍL發(fā)酵液１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液，以白色念珠菌為指示菌株，用生物管碟法［７］測(cè)定發(fā)酵液抗菌活性。

１．２．３菌株發(fā)酵條件優(yōu)化在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖、氮源酵母粉以及搖瓶裝液量和發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間４個(gè)因素采用Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化［８］，其中４因素分別為葡萄糖的濃度（ｇ／Ｌ）為５、１０、１５，酵母液的濃度（ｇ／Ｌ）２０、３０、４０，搖瓶裝液量（ｍL）３０、４０、５０，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間（ｈ）６６、７２、７８。

１．２．４抗生素的穩(wěn)定性研究熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。將發(fā)酵上清液置于９５ ℃處理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ后，測(cè)定其抗生素效價(jià)。不同ｐＨ條件下的穩(wěn)定性試驗(yàn)。將發(fā)酵液上清液分為３份，調(diào)節(jié)ｐＨ，使之分別處于酸、中、堿性環(huán)境中，在９５ ℃條件下處理１０ ｍｉｎ后，測(cè)定其抗生素效價(jià)。

２結(jié)果與分析

２．１菌株生長(zhǎng)過程觀察

３０ ℃恒溫培養(yǎng)２ ｄ后，平皿上出現(xiàn)紫色的小型菌落，表面光滑，周圍略微可見稀疏菌絲。鏡檢觀察可見少量氣生菌絲，顏色較深，菌絲粗而長(zhǎng)，分支較多。培養(yǎng)３ ｄ后，菌落紫色漸退，顏色趨灰色，表面干燥豐滿，邊緣絨狀菌絲增多。鏡檢發(fā)現(xiàn)氣生菌絲數(shù)量明顯增多，互相纏繞，部分菌絲前端出現(xiàn)白色透明的孢子絲。培養(yǎng)４ ｄ后，菌落明顯增大，顏色為灰色。此時(shí)氣生菌絲完全交錯(cuò)纏繞成團(tuán)狀，大量菌絲出現(xiàn)白色透明孢子絲，同時(shí)可見有少量孢子散落，顏色多呈白色透明。培養(yǎng)５ ｄ后，肉眼可見菌落表面多褶皺突起或顆粒，顏色灰色。鏡檢觀察到大量孢子形成，形成串狀或散落成顆粒，具深色。培養(yǎng)６ ｄ后，孢子散開成單個(gè)，或２個(gè)甚至多個(gè)呈鏈狀排列，孢子形狀多為橢圓或圓形，顏色深色，菌絲已經(jīng)完全消失。由此可知該菌株斜面生長(zhǎng)至６ ｄ后完全成熟，其菌落和細(xì)胞形態(tài)上與鏈霉菌屬放線菌相似。革蘭氏染色結(jié)果顯示菌株為陽(yáng)性菌。

２．２菌株發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

根據(jù)Ｌ９（３４）正交表對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果及數(shù)據(jù)處理見表１。由表１可知，當(dāng)葡萄糖為１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間保持在７２ ｈ時(shí)，菌株的發(fā)酵效價(jià)最高。按照該發(fā)酵組合進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)３次，發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為２．１８ ｃｍ，優(yōu)化結(jié)果符合預(yù)期。

由ｒ值可知，以上４個(gè)因素對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響程度由大到小依次為酵母液濃度、裝液量、發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間、葡萄糖濃度，因此在后續(xù)的進(jìn)一步發(fā)酵優(yōu)化時(shí)，可重點(diǎn)考慮對(duì)結(jié)果影響較大的一些因素。

２．３抗生素穩(wěn)定性分析。

１）熱穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)離心分離后的發(fā)酵液處于９５ ℃高溫處理１０、３０、６０、１２０ ｍｉｎ時(shí)，所對(duì)應(yīng)的抗生素對(duì)指示菌所產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為２．１６、２．１３、１．９６、１．８９、１．７６ ｃｍ。以上數(shù)據(jù)表明，該抗生素在９５ ℃條件下隨時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌效價(jià)的下降并不明顯，常溫下抑菌直徑為２．１６ ｃｍ，即使９５ ℃高溫處理１２０ ｍｉｎ，抑菌圈直徑仍有１．７６ ｃｍ，說明該抗生素對(duì)熱具有較高的穩(wěn)定性。試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，該發(fā)酵上清液在高溫下出現(xiàn)混濁現(xiàn)象，主要是蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生了變性并沉淀，預(yù)示可以采用高溫法去除發(fā)酵液中的部分蛋白質(zhì)等物質(zhì)。

２）抗生素在酸、中、堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，發(fā)酵液處于原液狀態(tài)時(shí)該抗生素對(duì)指示菌的抑菌圈直徑為２．１４ ｃｍ，當(dāng)改變發(fā)酵液ｐＨ為４、７、９時(shí)，抑菌圈直徑分別為２．１１、２．１０、０．８０ ｃｍ。以上數(shù)據(jù)表明，當(dāng)發(fā)酵上清液的ｐＨ為酸性和中性時(shí)，雖經(jīng)高溫處理，但該抗生素的抑菌效價(jià)變化很微小；而當(dāng)發(fā)酵上清液的ｐＨ為堿性時(shí)，該抗生素效價(jià)急劇下降，抑菌圈直徑由原液的２．１４ ｃｍ下降到０．８０ ｃｍ，說明該抗生素在酸性和中性環(huán)境中比較穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。試驗(yàn)過程發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵上清液在酸性條件下高溫處理１０ ｍｉｎ后，溶液濁度要大于其他條件；當(dāng)處于中性條件時(shí)，發(fā)酵上清液與其他條件相比最清澈， 這個(gè)現(xiàn)象可能與發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)變性有關(guān)，而且這些蛋白質(zhì)在酸性條件下更易變性。這種現(xiàn)象預(yù)示著在對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，可以通過改變其酸度來達(dá)到除去部分蛋白質(zhì)的目的。

３小結(jié)與討論

本試驗(yàn)對(duì)篩選獲得的一株產(chǎn)抗真菌抗生素的菌株進(jìn)行了初步研究。菌落和細(xì)胞形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株與鏈霉菌屬相似，斜面培養(yǎng)至６ ｄ菌株完全成熟。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)該菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳發(fā)酵工藝條件：葡萄糖１５ ｇ／Ｌ，酵母液４０ ｇ／Ｌ，裝液量３０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，發(fā)酵時(shí)間７２ ｈ。抗生素穩(wěn)定性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該抗生素具有較高的耐熱性，并在酸性和中性環(huán)境下具有相對(duì)較高的抑菌活性， 表明該菌具有一定的應(yīng)用潛力。今后將通過系統(tǒng)分類學(xué)方法進(jìn)一步明確該菌株的種屬關(guān)系，全面研究該抗生素分離純化工藝及其理化性質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

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