活性污泥中微生物群落多樣性及其研究方法進(jìn)展

余小玉

（廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院，廣東 佛山 528216）

目前，基于活性污泥法的污水處理工藝在污水處理系統(tǒng)中得到了廣泛應(yīng)用。活性污泥法實(shí)質(zhì)上是利用微生物新陳代謝降解有機(jī)污染物的生物處理技術(shù)，其處理效率以及出水水質(zhì)主要取決于組成活性污泥的微生物種類、數(shù)量、特性等。因此，對(duì)進(jìn)一步提高活性污泥法的處理效果、污泥減量化的機(jī)理等課題的深入研究都離不開(kāi)對(duì)活性污泥中微生物群落多樣性的研究。本文圍繞活性污泥中微生物種群多樣性展開(kāi)討論，并重點(diǎn)描述目前微生物多樣性的研究方法。

1 活性污泥中主要微生物菌群及其特性

作為活性污泥法的核心部分，其主要成分為微生物群體以及吸附的污水中的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)，是具有一定的活性和良好的凈水功能的褐色絮狀污泥。里面的微生物主要有細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和后生動(dòng)物等。其中起主要凈水作用的是細(xì)菌。經(jīng)研究，里面細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群有假單胞菌屬、螺菌屬、叢毛單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、黃桿菌屬和動(dòng)膠桿菌屬等。

2 微生物群落多樣性及其研究方法

在活性污泥水處理工藝中，深入了解活性污泥微生物多樣性，有助于提高污水處理系統(tǒng)的整體效果，降低處理成本。利用先進(jìn)的檢測(cè)手段，對(duì)活性污泥微生物多樣性進(jìn)行研究，已經(jīng)成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。本文將對(duì)幾種成熟先進(jìn)的微生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹。

2.1 Biolog方法

1989年，美國(guó) BIOLOG公司成功開(kāi)發(fā)了Biolog法，它是一種新型微生物鑒定方法。它的原理如下：在利用碳源過(guò)程中，微生物會(huì)產(chǎn)生自由電子。這些自由電子與四唑鹽染料發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生顏色。顏色越深，表明微生物對(duì)碳源的利用程度就越高。微生物的種類和固有性質(zhì)不同，那么它們對(duì)不同碳源的利用能力就不一樣。該技術(shù)擺脫傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限性，能定性定量分析微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)（FCM）

流式細(xì)胞術(shù)是運(yùn)用流式細(xì)胞儀，使細(xì)胞或微粒在液流中流動(dòng)，逐個(gè)通過(guò)一束入射光束，并用高靈敏度檢測(cè)器記錄下散射光及各種熒光信號(hào)，對(duì)液流中的細(xì)胞或其他微粒進(jìn)行快速測(cè)量。此技術(shù)具有方法靈活、測(cè)量速度快、采集數(shù)據(jù)量大、靈敏度高、特異性好、測(cè)量參數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)。局限性主要是需要制備單細(xì)胞懸液、需專業(yè)操作人員、標(biāo)本需前處理以及設(shè)備昂貴等。

2.3 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

熒光原位雜交技術(shù)最早是由Gall和Pardue提出來(lái)的，自提出后，又先后經(jīng)歷了放射性標(biāo)記探針和熒光標(biāo)記探針兩個(gè)階段。該技術(shù)將細(xì)胞原位雜交技術(shù)和熒光技術(shù)有機(jī)結(jié)合，檢測(cè)靈敏度高、安全便捷，而且能快速獲得結(jié)果。一般的核酸抽提和PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生一定程度的偏差，而FISH卻恰好可以避免此偏差，并且能同時(shí)檢測(cè)幾種微生物。

2.4 生物標(biāo)記物法（Biomaker）

微生物的細(xì)胞均有其特有的脂肪酸、呼吸醌等環(huán)境樣品信號(hào)，而生物標(biāo)記物法（biomarker）即是利用此特點(diǎn)，能夠在分類學(xué)上通過(guò)這類環(huán)境樣品信號(hào)來(lái)表征微生物種類，從而區(qū)分、鑒定細(xì)菌的屬、種甚至是株。生物標(biāo)記法可以避免如形態(tài)觀察等傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法帶來(lái)的人為誤差，它能夠定性定量分析樣品中的微生物群落差異。典型的生物標(biāo)記物法包括脂肪酸圖譜分析技術(shù)、醌類圖譜分析技術(shù)等。

2.5 變性/溫度地圖凝膠電泳（DGGE/ TGGE）

變性/溫度梯度凝膠電泳的原理如下：在電場(chǎng)中，在變性濃度差異或溫度差異的條件下，微生物的雙鏈DNA片斷的裂解是不一樣的， PCR產(chǎn)物中長(zhǎng)度相同但序列不同的 DNA 標(biāo)記片斷（rRNA或rDNA）將被分離。經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)后，得出DGGE/TGGE 指紋圖譜。從理論上講，該指紋圖譜上的一個(gè)條帶就代表一個(gè)微生物類群，一般能鑒別到屬，有時(shí)候甚至到種。而指紋圖譜上的條帶數(shù)量的多寡以及條帶的亮度代表著該種微生物的多寡，因此，指紋圖譜不僅直觀地反映了微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性，還可判斷出優(yōu)勢(shì)菌或功能菌。筆者的《淺淡PCR－DGGE技術(shù)在剩余污泥減量機(jī)理研究中的應(yīng)用》里有詳細(xì)描述。

2.6 擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）

擴(kuò)增rDNA限制性酶切片段分析法的技術(shù)原理是基于PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增rDNA片段（如16S rDNA、23S rDNA、16S-23SrDNA片段），再對(duì)擴(kuò)增的rDNA片段進(jìn)行RFLP。ARDRA技術(shù)一般都需要同其它的分子技術(shù)如DGGE、T-RFLP等相結(jié)合使用。

2.7 T-RFLP

末端限制性片段多態(tài)性T-RFLP法是由RFLP發(fā)展而來(lái)的，又稱為16S rRNA 基因的末端限制性片段， 是繼DGGE/TGGE、SSCP、FISH 技術(shù)、克隆文庫(kù)之后發(fā)展起來(lái)的，具有如下幾個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)：1）結(jié)果可重復(fù)顯現(xiàn)，因而利用該技術(shù)對(duì)樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性定量分析的結(jié)果也是可靠的；2）結(jié)果數(shù)據(jù)化，數(shù)據(jù)具體化，從而更加科學(xué)和準(zhǔn)確；3）跟其他分析方法相比，更容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化監(jiān)測(cè)，操作簡(jiǎn)捷，靈敏高效；4）樣品的基因序列可構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，可以推斷系統(tǒng)發(fā)育的程度，更具有直接參考意義。綜上所述，由于擁有這些無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，T-RFLP技術(shù)用來(lái)進(jìn)行活性污泥中微生物群落多樣性的研究也是可行的。

3 展望

活性污泥中的微生物菌群隨著現(xiàn)代研究技術(shù)的發(fā)展逐漸被人們所認(rèn)知。目前來(lái)說(shuō)，單一的研究方法已經(jīng)基本趨于成熟，但是每一種方法都有其局限性，一些實(shí)驗(yàn)誤差是不可避免的。而綜合運(yùn)用多種層次上的技術(shù)可以從一定程度上解決單一方法所帶來(lái)的局限性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確真實(shí)、有說(shuō)服力。

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