西南三地區野生香菇ISSR遺傳多樣性分析

張婉潔+何德+李翠新+李季+

摘要：采用ＩＳＳＲ分子標記技術對云南省大姚縣、瑞麗市和四川省木里縣的４１株野生香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）菌株進行ＤＮＡ聚類分析，利用ＮＴＳＹＳ軟件對其遺傳多樣性進行聚類分析。結果表明，利用１８個引物對４１個野生香菇菌株的ＤＮＡ進行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增，共擴增出１６２條清晰的ＤＮＡ片段。聚類分析結果表明，相似水平在６２％左右時，４１株野生香菇菌株分為３個類群，各地香菇資源存在較豐富的遺傳多樣性且與地域無明顯相關性。

關鍵詞：香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）；ＩＳＳＲ；遺傳多樣性；ＤＮＡ聚類分析

中圖分類號：Ｓ６４６．１＋２；Ｑ５０３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2093-04

Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｌd Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｔｈｒｅｅ Ｐｌａｃｅｓ ｏｆ

Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔern Ｃｈｉｎａ Based on ＩＳＳＲ-PCR

ＺＨＡＮＧ Ｗａｎ－ｊｉｅ， ＨＥ Ｄｅ， ＬＩ Ｃｕｉ－ｘｉｎ， ＬＩ Ｊｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ４１ ｗｉｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｐｌａｃｅｓ Ｄａｙａｏ ｃｏｕｎｔｒｙ， Ｒｕｉｌｉ ｃｏｕｎｔｒｙ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｍｕｌｉ ｃｏｕｎｔｒｙ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗere ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ with ISSR-POR. Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＮＴＳＹＳ－ＰＣ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ １６２ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＤＮＡ ｂａｎｄｓ were produced from 18 pairs of primers． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔs ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４１ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ ａｔ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ６２％， ｉｍｐｌying ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗｉｌｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ ｈａｄ ｇｒｅａｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ；ＩＳＳＲ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ＤＮＡ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ

香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）是一種可食用的大型木腐擔子菌［１］，具有較高的營養價值和藥用價值。含有高蛋白、多糖、低脂肪等諸多的營養［２，３］，這使得香菇成為世界上產業發展速度最快的菇類［３］。我國幅員遼闊、氣候復雜、地形多變、香菇野生品種繁多，但是由于分化程度低、形態差異小，要以形態特征為依據難以對品種進行有效鑒定；栽培規模的迅速擴大和自然生境的逐漸減少，迫切需要加快香菇種質資源的研究，加緊對野生香菇進行遺傳多樣性研究。

ＩＳＳＲ分子標記技術（Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ， ＩＳＳＲ）于１９９４年由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等［４］提出，利用在真核生物基因組中經常出現的簡單重復序列本身來設計引物進行ＰＣＲ擴增［５］。ＩＳＳＲ分子標記己應用于研究植物種內遺傳變異、種間遺傳變異［６］、品種鑒定［７，８］、遺傳作圖［９］和居群遺傳學［１０］等研究中，在遺傳多樣性和親緣關系［１１］研究中的應用更為廣泛。本研究利用ＩＳＳＲ分子標記技術對西南地區的云南省瑞麗市、大姚縣和四川省木里縣的野生香菇進行了遺傳多樣性分析，以期能客觀反映香菇屬真菌的親緣關系和地理變遷情況。

１材料與方法

１．１供試菌株

供試４１個香菇菌株的編號、采集地點等詳見表１。

１．２方法和步驟

１．２．１基因組ＤＮＡ的提取將低溫保存的４１個野生香菇菌種接種于ＰＤＡ斜面培養基上，２６ ℃培養 ７～１０ ｄ。活化后用接種針挑取試管斜面培養基上邊緣處生長較旺盛的菌塊，接種到液體培養基中，于室溫下靜置培養１個月后，用濾紙收集香菇菌絲體，用吸水紙吸干，參照 ＣＴＡＢ法［１２］并作改良以提取其ＤＮＡ，于－２０ ℃保存備用。

１．２．２ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增擴增反應的體系為１５ μＬ，包含ＰＣＲ緩沖液１．５ μＬ、２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２ １．２ μＬ、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ １．２ μＬ、１０ μｍｏｌ／Ｌ引物０．３ μＬ、Ｅｘ－Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（大連寶生物工程有限公司）０．０７５ μＬ、０．００１ μｇ／ｍＬ模板１ μＬ，最后用去離子水將總體積補至１５ μＬ。

ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應程序為：９４ ℃預變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，４８～５５ ℃范圍內退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１０８ ｓ，３３個循環；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ，４ ℃保存。

１）引物篩選。以４１株野生香菇菌株為ＤＮＡ模板，通過ＴＭ值比較，對Ｐ１～Ｐ２７號引物進行分組和初篩選，ＴＭ值相近的為一組，篩選出清晰、重復性好、多態性高的ＰＣＲ擴增引物。

２）ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 條件優化。由于ＩＳＳＲ 標記易受 ＰＣＲ 條件的影響，因此需對ＰＣＲ擴增反應進行優化。

退火溫度的優化：使用引物Ｐ１４和Ｐ２０對８１０４菌株模板進行ＰＣＲ擴增，篩選最佳退火溫度。擴增反應在梯度 ＰＣＲ 儀（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ公司）上進行，設最小溫度為 ４７．３ ℃，最大溫度為５５．３ ℃，自動形成８個溫度梯度，分別為５５．３、５４．９、５４．０、５２．４、５０．５、４８．９、４７．９、４７．３ ℃。

鎂離子濃度的優化：使用引物Ｐ１４對８１０４菌株模板進行ＰＣＲ擴增來優化鎂離子濃度，Ｍｇ２＋濃度的優化范圍為１．６～２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ（即ＭｇＣｌ２的用量為 ０．９６～１．５ μＬ），Ｍｇ２＋濃度設１０個梯度，分別為１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ 。

３）ＰＣＲ擴增及產物檢測。用優化后的反應體系（表２）和篩選出來的１８個引物（表３）進行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ 擴增后，取４ μＬ的ＰＣＲ 擴增產物加少量６×Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ，于濃度為１．０％的瓊脂糖凝膠（含０．５ μｇ／ｍＬ的ＥＢ）上電泳，并于ＢＩＯ ＲＡＤ Ｇｅｌ ＤｏｃＴＭ ＸＲ＋凝膠成像系統成像。

１．２．３數據分析利用凝膠系統成像軟件把條帶信息轉化為０－１矩陣。即對所有引物的電泳條帶進行記錄，在相同位置出現條帶的記為１，無條帶的記為０。然后采用ＮＴＳＹＳ軟件進行遺傳相似性聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

２結果與分析

２．１ＤＮＡ的提取

將所采４１個野生香菇菌株用ＣＴＡＢ法進行ＤＮＡ的提取，結果見圖１。如圖１所示，得到的野生香菇菌株ＤＮＡ約２３ １３０ ｂｐ，且ＤＮＡ電泳條帶清晰，ＤＮＡ的純度、濃度及產率都比較高，無降解，適用于ＩＳＳＲ分子標記分析。

２．２ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增結果

用篩選得到的１８個引物對所有供試菌株進行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增，擴增產物用１．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所測結果見圖２、３。如圖２、３所示，可以看到同一引物對不同的香菇菌株擴增后所得到的ＤＮＡ條帶清晰度和多態性均很高，說明所建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系適合野生香菇菌株的ＰＣＲ擴增，可用于遺傳多樣性分析。經統計，１８個引物對４１個野生香菇菌株擴增后，共檢測到１６２條條帶，多態性條帶為１６２條，多態率為１００％。

２．３聚類分析結果

根據ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析結果，采用ＮＴＳＹＳ軟件進行聚類分析，得到４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ聚類分析圖（圖４），供試的４１個野生香菇菌株相似系數為０．６０～０．８５。其中８０４１和８０４３號野生香菇菌株的相似系數達到了０．８５以上，說明它們的遺傳背景極為相似，而且兩者的采集地都來自云南省大姚縣，因此可能是相同的菌株，存在同物異名的可能性。在相似系數０．６２左右，４１個野生香菇菌株可以分為三大類，其中８１２７、８１１０、８１３５號３個野生香菇菌株聚為一類（Ⅲ），都來源于四川省木里縣，８１１０號野生香菇來自于木里縣列瓦鄉三村，８１２７和８１３５號野生香菇都來自木里縣集市；聚為第二類（Ⅱ）的菌株有４個：８０８０、８０７７、８１３９、８０７９號野生香菇菌株，除了８１３９號野生香菇來自四川省木里縣集市，其余３個均來自云南省瑞麗市；其他３４個野生香菇菌株聚為第一類（Ⅰ），其中云南省的香菇有９個，四川省的香菇有２５個，說明這些菌株的遺傳背景相似，親緣關系比較近。

聚類結果還表明，地理位置來源相同的野生香菇菌株分布在不同的ＩＳＳＲ聚類中，比如第一類中包含了來自木里縣、大姚縣和瑞麗市的菌株，反映出這３個地方的菌株不同地理群體間差異不大，而第二類中包含了瑞麗市和木里縣的菌株，和第一類情況相同，說明ＩＳＳＲ聚類分析與菌株的不同地理來源之間無明顯的相關性。

３討論

遺傳多樣性一般是指種內的遺傳差異水平，反映一個物種適應環境的能力以及其被改造和利用的潛力［１３］。本試驗中，４１個野生香菇菌株的遺傳相似系數為０．６０～０．８５，在不同的聚類分組中，遺傳相似系數也存在一定的差異，這些差異可能是野生香菇對環境的適應所造成的，分析表明同一地區不同的野生香菇菌株間遺傳差異很大，反映出了豐富的群體內的遺傳多樣性。這與王子迎等［１４］、趙曉清等［１５］的研究結論一致。

Ｘｕ等［１６］的研究結果表明，作為香菇的起源地之一，我國是重要的野生香菇種質資源中心，不同區域的菌株間存在著較大的遺傳差異。本研究對四川省木里縣和云南省瑞麗市、大姚縣３個地區４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ遺傳多樣性分析表明，３個地區間野生香菇菌株存在混雜現象，不同地理位置的群體并沒有表現出地理隔離的差異。

參考文獻：

［１］ 徐學鋒，林范學，程水明，等．中國香菇自然種質的ｒＤＮＡ遺傳多樣性分析［Ｊ］． 菌物學報，２００５，２４（１）：２９－３５．

［２］ 鄧旺秋，楊小兵，李泰輝，等．廣東省香菇栽培菌株ＲＡＰＤ多態性分析［Ｊ］．食用菌學報，２００４，１１（１）：７－１１．

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［４］ ＺＩＥＴＫＩEＷＩＣZ Ｅ，ＲＡＦＡＬＳＨＩ Ａ，ＬＡＢＵＤＡ Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ） －ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０（２）：１７６－１８３．

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［６］ ＳＵＤＵＰＡＫ Ｍ Ａ．Ｉｎｔｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａ－ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ （ＩＳＳＲ） ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Cｉｃｅｒ［Ｊ］． Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００４， １３５（２）：２２９－２３８．

［７］ ＮＡＧＯＫＡ Ｔ，ＯＧＩＨＡＲＡ Ｙ．Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ iｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ＲＦＬＰ ａｎｄ ＲＡＰＤ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７，９４（５）：５９７－６０２．

［８］ ＰＲＥＶＯＳＴ Ａ，ＷＩＬＫＩＮＳＯＮ Ｍ Ｊ．Ａ ｎｅｗ ｓｙｓｍｔｅｒｍ ｏｆ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ＩＳＳＲ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｐｏｔａｔｏ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ［Ｊ］． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９８，９８（１）：１０７－１１２．

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［１１］ 馬朝芝，傅廷棟，ＴＵＥＶＥＳＳＯＮ Ｓ，等．用ＩＳＳＲ標記技術分析中國和瑞典甘藍型油菜的遺傳多樣性［Ｊ］．中國農業科學，２００３， ３６（１１）：１４０３－1４０８．

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［１３］ 馬文輝，何平．ＲＡＰＤ標記在植物系統進化研究中的應用［Ｊ］.西南師范大學學報（自然科學版），１９９９，２４（４）：４８２－４９1．

［１４］ 王子迎，王書通．安徽野生香菇遺傳多樣性及雜種優勢的ＩＳＳＲ分析［Ｊ］．菌物學報，２００６，２５（２）：２１１－２１６．

［１５］ 趙曉清，王波，王一，等．利用ＩＳＳＲ分析野生蘑菇與雙孢蘑菇的遺傳多樣性［Ｊ］．四川大學學報（自然科學版），２００９，４６（４）：１１３０－１１３４．

［１６］ ＸＵ Ｘ Ｆ，ＬＩＮ Ａ Ｚ，ＣＨＥＮ Ｓ Ｍ，ｅｔ ａ１． Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｓｉａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，１６（３）：２７４－２８０．

２結果與分析

２．１ＤＮＡ的提取

將所采４１個野生香菇菌株用ＣＴＡＢ法進行ＤＮＡ的提取，結果見圖１。如圖１所示，得到的野生香菇菌株ＤＮＡ約２３ １３０ ｂｐ，且ＤＮＡ電泳條帶清晰，ＤＮＡ的純度、濃度及產率都比較高，無降解，適用于ＩＳＳＲ分子標記分析。

２．２ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增結果

用篩選得到的１８個引物對所有供試菌株進行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增，擴增產物用１．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所測結果見圖２、３。如圖２、３所示，可以看到同一引物對不同的香菇菌株擴增后所得到的ＤＮＡ條帶清晰度和多態性均很高，說明所建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系適合野生香菇菌株的ＰＣＲ擴增，可用于遺傳多樣性分析。經統計，１８個引物對４１個野生香菇菌株擴增后，共檢測到１６２條條帶，多態性條帶為１６２條，多態率為１００％。

２．３聚類分析結果

根據ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析結果，采用ＮＴＳＹＳ軟件進行聚類分析，得到４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ聚類分析圖（圖４），供試的４１個野生香菇菌株相似系數為０．６０～０．８５。其中８０４１和８０４３號野生香菇菌株的相似系數達到了０．８５以上，說明它們的遺傳背景極為相似，而且兩者的采集地都來自云南省大姚縣，因此可能是相同的菌株，存在同物異名的可能性。在相似系數０．６２左右，４１個野生香菇菌株可以分為三大類，其中８１２７、８１１０、８１３５號３個野生香菇菌株聚為一類（Ⅲ），都來源于四川省木里縣，８１１０號野生香菇來自于木里縣列瓦鄉三村，８１２７和８１３５號野生香菇都來自木里縣集市；聚為第二類（Ⅱ）的菌株有４個：８０８０、８０７７、８１３９、８０７９號野生香菇菌株，除了８１３９號野生香菇來自四川省木里縣集市，其余３個均來自云南省瑞麗市；其他３４個野生香菇菌株聚為第一類（Ⅰ），其中云南省的香菇有９個，四川省的香菇有２５個，說明這些菌株的遺傳背景相似，親緣關系比較近。

聚類結果還表明，地理位置來源相同的野生香菇菌株分布在不同的ＩＳＳＲ聚類中，比如第一類中包含了來自木里縣、大姚縣和瑞麗市的菌株，反映出這３個地方的菌株不同地理群體間差異不大，而第二類中包含了瑞麗市和木里縣的菌株，和第一類情況相同，說明ＩＳＳＲ聚類分析與菌株的不同地理來源之間無明顯的相關性。

３討論

遺傳多樣性一般是指種內的遺傳差異水平，反映一個物種適應環境的能力以及其被改造和利用的潛力［１３］。本試驗中，４１個野生香菇菌株的遺傳相似系數為０．６０～０．８５，在不同的聚類分組中，遺傳相似系數也存在一定的差異，這些差異可能是野生香菇對環境的適應所造成的，分析表明同一地區不同的野生香菇菌株間遺傳差異很大，反映出了豐富的群體內的遺傳多樣性。這與王子迎等［１４］、趙曉清等［１５］的研究結論一致。

Ｘｕ等［１６］的研究結果表明，作為香菇的起源地之一，我國是重要的野生香菇種質資源中心，不同區域的菌株間存在著較大的遺傳差異。本研究對四川省木里縣和云南省瑞麗市、大姚縣３個地區４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ遺傳多樣性分析表明，３個地區間野生香菇菌株存在混雜現象，不同地理位置的群體并沒有表現出地理隔離的差異。

參考文獻：

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［４］ ＺＩＥＴＫＩEＷＩＣZ Ｅ，ＲＡＦＡＬＳＨＩ Ａ，ＬＡＢＵＤＡ Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｂｙ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ（ＳＳＲ） －ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０（２）：１７６－１８３．

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２結果與分析

２．１ＤＮＡ的提取

將所采４１個野生香菇菌株用ＣＴＡＢ法進行ＤＮＡ的提取，結果見圖１。如圖１所示，得到的野生香菇菌株ＤＮＡ約２３ １３０ ｂｐ，且ＤＮＡ電泳條帶清晰，ＤＮＡ的純度、濃度及產率都比較高，無降解，適用于ＩＳＳＲ分子標記分析。

２．２ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增結果

用篩選得到的１８個引物對所有供試菌株進行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增，擴增產物用１．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所測結果見圖２、３。如圖２、３所示，可以看到同一引物對不同的香菇菌株擴增后所得到的ＤＮＡ條帶清晰度和多態性均很高，說明所建立的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反應體系適合野生香菇菌株的ＰＣＲ擴增，可用于遺傳多樣性分析。經統計，１８個引物對４１個野生香菇菌株擴增后，共檢測到１６２條條帶，多態性條帶為１６２條，多態率為１００％。

２．３聚類分析結果

根據ＩＳＳＲ－ＰＣＲ分析結果，采用ＮＴＳＹＳ軟件進行聚類分析，得到４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ聚類分析圖（圖４），供試的４１個野生香菇菌株相似系數為０．６０～０．８５。其中８０４１和８０４３號野生香菇菌株的相似系數達到了０．８５以上，說明它們的遺傳背景極為相似，而且兩者的采集地都來自云南省大姚縣，因此可能是相同的菌株，存在同物異名的可能性。在相似系數０．６２左右，４１個野生香菇菌株可以分為三大類，其中８１２７、８１１０、８１３５號３個野生香菇菌株聚為一類（Ⅲ），都來源于四川省木里縣，８１１０號野生香菇來自于木里縣列瓦鄉三村，８１２７和８１３５號野生香菇都來自木里縣集市；聚為第二類（Ⅱ）的菌株有４個：８０８０、８０７７、８１３９、８０７９號野生香菇菌株，除了８１３９號野生香菇來自四川省木里縣集市，其余３個均來自云南省瑞麗市；其他３４個野生香菇菌株聚為第一類（Ⅰ），其中云南省的香菇有９個，四川省的香菇有２５個，說明這些菌株的遺傳背景相似，親緣關系比較近。

聚類結果還表明，地理位置來源相同的野生香菇菌株分布在不同的ＩＳＳＲ聚類中，比如第一類中包含了來自木里縣、大姚縣和瑞麗市的菌株，反映出這３個地方的菌株不同地理群體間差異不大，而第二類中包含了瑞麗市和木里縣的菌株，和第一類情況相同，說明ＩＳＳＲ聚類分析與菌株的不同地理來源之間無明顯的相關性。

３討論

遺傳多樣性一般是指種內的遺傳差異水平，反映一個物種適應環境的能力以及其被改造和利用的潛力［１３］。本試驗中，４１個野生香菇菌株的遺傳相似系數為０．６０～０．８５，在不同的聚類分組中，遺傳相似系數也存在一定的差異，這些差異可能是野生香菇對環境的適應所造成的，分析表明同一地區不同的野生香菇菌株間遺傳差異很大，反映出了豐富的群體內的遺傳多樣性。這與王子迎等［１４］、趙曉清等［１５］的研究結論一致。

Ｘｕ等［１６］的研究結果表明，作為香菇的起源地之一，我國是重要的野生香菇種質資源中心，不同區域的菌株間存在著較大的遺傳差異。本研究對四川省木里縣和云南省瑞麗市、大姚縣３個地區４１個野生香菇菌株的ＩＳＳＲ遺傳多樣性分析表明，３個地區間野生香菇菌株存在混雜現象，不同地理位置的群體并沒有表現出地理隔離的差異。

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