重組血管緊張素轉化酶抑制肽工程菌細胞破碎條件優化

李艷+孫海燕+周麗珍+劉冬

摘要： 以重組血管緊張素轉化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎率、破碎液中目的融合蛋白濃度（ＧＳＴ－ＡＨＰ）為主要考察指標，對重組血管緊張素抑制肽工程菌破碎條件進行了優化。結果表明，其最佳工藝條件為每克濕菌體重懸于３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ緩沖液中，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ后超聲破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ取上清液。在此最佳工藝條件下破碎液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到１．８３ ｇ／Ｌ。

關鍵詞：重組血管緊張素轉化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）；工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）；破碎條件

中圖分類號：ＴＱ９２５文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）09－2127-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ－Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１

ＬＩ Ｙａｎ，ＳＵＮ Ｈａｉ－ｙａｎ，ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｚｈｅｎ，ＬＩＵ Ｄｏｎｇ

（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｎｉｃ／Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ ５１８０５５，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂａｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎs ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ， Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ） ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗere ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ using ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＳＴ－ＡＨＰ） ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｓ ｉｎｄｉｃｅｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍal ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ ｓｕｓｐｅｎｄing ｐｅｌｌｅｔ ｉｎ ３ ｍＬ ｏｆ １×ＰＢＳ ｗｉｔｈ ２ ｍｍｏｌ／ｍＬ ＥＤＴＡ ｐｅｒ ｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ａｄｄing ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｔｏ ２０ ０００ Ｕ／ｍＬ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ３０ ｍｉｎ ａｆｔｅｒ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ， taking ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ ａｔ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ ｆｏｒ １０ ｍｉｎ ａｔ ４ °Ｃ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＳＴ－ＡＨＰ ｉｎ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ １．８３ ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ； ｃｅｌｌ－ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ

血管緊張素轉化酶抑制肽（ＡＣＥＩＰ）是一類通過抑制血管緊張素轉化酶活性從而達到降低血壓的小分子多肽，具有降壓效果明顯、無毒副作用等特點［１－４］。ＡＣＥＩＰ可通過特異性酶解從天然動植物和微生物蛋白中提取，但由于天然蛋白中ＡＣＥＩＰ含量很低，因而產率低、成本高，難以產業化。化學合成方法可以按照人們的意愿合成制備任意活性的ＡＣＥＩＰ，但大都因成本高、副反應物多及化合物殘留等問題制約其產業化發展。近年來利用微生物基因工程技術生產蛋白質多肽藥物和食品原料由于具有表達高效、產量高、成本低等優點而越來越得到廣泛應用。

本研究通過分析ＡＣＥＩＰ結構與降血壓活性之間的關系，設計出高活性的ＡＣＥＩＰ單體，并利用基因工程手段克隆到大腸桿菌融合表達載體ｐＧＥＸ－４Ｔ－２之上，構建了能高效穩定表達ＡＣＥＩＰ的基因工程菌Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）［５］。由于該工程菌表達的ＡＣＥＩＰ屬胞內表達，因而如何通過經濟高效的細胞破碎工藝將胞內表達的ＡＣＥＩＰ溶出成為ＡＣＥＩＰ分離純化的關鍵步驟之一［６］。因此，本研究以細胞破碎率、破碎液中目的融合蛋白濃度為主要考察指標，對構建的基因工程菌的細胞破碎條件進行了優化。研究結果將為后續的進一步分離純化奠定基礎。

１材料與方法

１．１材料與儀器

基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）自制；二硫蘇糖醇（ＤＴＴ），加拿大ＢＢＩ分裝，超純；三羥甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）、甘氨酸、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ， ２０ ０００ Ｕ／ｍｇ），加拿大ＢＢＩ公司產品；丙烯酰胺、亞甲雙丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ，－四甲基乙烯二胺（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸胺（ＡＰＳ）、β－ＭＥ（β－巰基乙醇），美國Ａｍｒｅｓｃｏ公司產品；十二烷基磺酸鈉（ＳＤＳ）、考馬斯亮藍Ｒ－２５０，Ｆｌｕｋａ產品；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｒｋｅｒ（Ｍ．Ｗ．１４．４～１１６．０ ｋＤａ），購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；ＢＣＡ蛋白檢測試劑盒，購自Ｐｉｅｒｃｅ公司。

Ｂｉｏｓｔａｔ Ｃ型 ３０ Ｌ發酵罐，德國貝朗公司；垂直電泳槽、ＣＯＮＳＯＲＴ Ｅ８６１型電泳儀，美國ＵＶＰ公司；ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ凝膠成像系統，Ｓｙｎｇｅｎｅ公司；超聲波破碎儀（ＶＣ×６００型），Ｓｏｎｉｃｓ公司；核酸蛋白檢測儀，德國Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。

１．２試驗方法

１．２．１發酵液的制備活化基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ），通過菌種擴增，再進行高密度發酵。具體操作如下：活化后的基因工程菌按１％接種量轉接至１００ ｍＬ含氨芐青霉素（Ａｍｐ）的 ２×ＹＴＡ培養基，３７ ℃、２５０ ｒ／ｍｉｎ培養８ ｈ。再按１０％接種量轉接至含２０ Ｌ發酵培養基的３０ Ｌ發酵罐中，控制溶氧４０％，ｐＨ７．０，３７ ℃進行發酵。培養２ ｈ后開始補料，補料速度１ ｍＬ／ｍｉｎ，補料１ ｈ，培養３ ｈ后加入誘導劑誘導６ ｈ，共發酵９ ｈ制得發酵液。

１．２．２目的蛋白含量的測定采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白電泳法，用凝膠成像系統照相保存，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ軟件分析目的融合蛋白（ＧＳＴ－ＡＨＰ）含量。

１．２．３總蛋白含量的測定采用ＢＣＡ法。堿性條件下，蛋白質將Ｃｕ２＋還原為Ｃｕ＋， Ｃｕ＋與ＢＣＡ試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在５６２ ｎｍ處的吸光度，并與標準曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度。具體操作如下：將標準蛋白牛血清白蛋白（ＢＳＡ）用１×ＰＢＳ稀釋成濃度分別為２５、１２５、２５０、５００、１ ０００、１ ５００、２ ０００ μｇ／ｍＬ的標準品溶液，取１００ μＬ不同濃度的標準品溶液加入１ ｍＬ工作液，３７ ℃反應３０ ｍｉｎ，測定ＯＤ５６２ ｎｍ。以蛋白質濃度（μｇ／ｍＬ）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

１．２．４ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的確定根據“１．２．３”所得總蛋白含量及“１．２．２”所得ＧＳＴ－ＡＨＰ含量計算ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度。

１．２．５酶法與反復凍融法相結合破碎菌體發酵液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄上清液收集菌體沉淀，用１×ＰＢＳ緩沖液洗滌２次，稱重記錄濕菌體的質量。按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，冰浴３０ ｍｉｎ后，－７０ ℃冷凍、２５ ℃水浴消融，反復凍融８次。每凍融１次，鏡檢計算破碎率；同時取１ ｍＬ 細胞裂解液，用針筒將２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００強行注入黏的細胞裂解液中至終濃度為１％，溫和混合３０ ｍｉｎ后，加入ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ至終濃度為５ μｇ／ｍＬ，４ ℃振蕩１０ ｍｉｎ。１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ收集上清液，取１０ μＬ上清液進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。

１．２．６酶法與超聲波法相結合破碎菌體按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ。取２００ ｍＬ酶解液超聲波破碎，每破碎５ ｍｉｎ取樣１次，鏡檢計算破碎率；同時取樣１ ｍＬ，離心收集上清液取１０ μＬ上樣進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。超聲波處理參數：Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。共破碎４０ ｍｉｎ。

２結果與分析

２．１標準曲線的繪制

標準曲線見圖１。以蛋白質濃度（μｇ／ｍＬ）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得回歸方程：ｙ＝０．００１ ３ｘ＋０．０４５ ９，Ｒ２＝０．９９７。

２．２酶法與反復凍融法相結合的破碎條件研究結果

２．２．１凍融次數對菌體破碎率的影響結果見圖２。由圖２可見，隨著凍融次數的增多，菌體破碎率增加，當反復凍融５次時，破碎率已達９０％，６次時即達１００％。

２．２．２凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖３和圖４。由圖３和圖４可見，反復凍融６次時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度已達到最大。因此反復凍融的次數確定為６次。此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達１．８６ ｇ／Ｌ。

２．３酶法和超聲波法相結合的破碎條件研究結果

２．３．１超聲時間對菌體破碎率的影響結果見圖５。由圖５可見，隨著超聲時間的延長，菌體破碎率增加，當超聲時間達到３０ ｍｉｎ時，菌體破碎率達到１００％。

２．３．２超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖６和圖７。由圖６和圖７可見，超聲時間達３０ ｍｉｎ時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大（１．８３ ｇ／Ｌ），超聲時間進一步延長，ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度不再增加。因此確定超聲破碎時間以３０ ｍｉｎ為宜。

２．４兩種方法的破碎效果比較

反復凍融６次或超聲波破碎３０ ｍｉｎ，細胞破碎率均可達到１００％，此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大，分別為１．８６和１．８３ ｇ／Ｌ。反復凍融法操作較繁瑣，耗時長，需要添加價格昂貴的ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ降解ＤＮＡ及ＲＮＡ以降低破碎液黏度，且每次處理量不能太大；而超聲波破碎時間短、效率高，且對細胞破碎所釋放的ＤＮＡ、ＲＮＡ具有一定剪切作用，破碎同時能有效降低其黏度，綜合考慮選擇超聲波破碎為工程菌細胞破碎條件。

３結論

試驗結果表明，重組血管緊張素轉化酶抑制肽工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎的最優工藝條件為：每克濕菌體重懸于３ｍＬ含有２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ緩沖液中，加溶菌酶至終濃度為２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ后超聲波破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ取上清液。超聲波破碎條件：Ｓｏｎｉｃｓ（ＶＣ×６００型）超聲波破碎儀，Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。此條件下上清液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到１．８３ ｇ／Ｌ。

參考文獻：

［１］ ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｎ，ＥＪＩＲＩ Ｍ， ＭＩＺＵＮＯ Ｓ． Ｂｉｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ，２００３，９（１６）：１３４５－１３５５．

［２］ 李世敏，劉冬，孫海燕，等．玉米活性多肽降血壓作用及其機制的研究［Ｊ］．營養學報，２００７，２９（２）：１８６－１８８．

［３］ ＦＵＪＩＴＡ Ｈ， ＹＯＫＯＹＡＭＡ Ｋ， ＹＯＳＨＩＫＡＷＡ Ｍ． Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ Ｉ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ， ２０００，６５（４）：５６４－５６９．

［４］ ＦＩＴＺ ＧＥＲＡＬＤ Ｒ Ｊ，ＭＥＩＳＥＬ Ｈ．Ｍｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ-Ｉ－ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］． Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ， ２０００， ８４（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ３３－Ｓ３７．

［５］ ＬＩＵ Ｄ， ＳＵＮ Ｈ Ｙ， ＺＨＡＮＧ Ｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｉｌｋ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００７，５５：５１０９－５１１２．

［６］ 劉冬，吳亞麗，張麗君，等．重組降血壓肽基因工程菌破碎方法研究［Ｊ］．河南工業大學學報（自然科學版），２００６，２７（３）：５３－５６．

１．２．４ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的確定根據“１．２．３”所得總蛋白含量及“１．２．２”所得ＧＳＴ－ＡＨＰ含量計算ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度。

１．２．５酶法與反復凍融法相結合破碎菌體發酵液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄上清液收集菌體沉淀，用１×ＰＢＳ緩沖液洗滌２次，稱重記錄濕菌體的質量。按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，冰浴３０ ｍｉｎ后，－７０ ℃冷凍、２５ ℃水浴消融，反復凍融８次。每凍融１次，鏡檢計算破碎率；同時取１ ｍＬ 細胞裂解液，用針筒將２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００強行注入黏的細胞裂解液中至終濃度為１％，溫和混合３０ ｍｉｎ后，加入ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ至終濃度為５ μｇ／ｍＬ，４ ℃振蕩１０ ｍｉｎ。１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ收集上清液，取１０ μＬ上清液進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。

１．２．６酶法與超聲波法相結合破碎菌體按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ。取２００ ｍＬ酶解液超聲波破碎，每破碎５ ｍｉｎ取樣１次，鏡檢計算破碎率；同時取樣１ ｍＬ，離心收集上清液取１０ μＬ上樣進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。超聲波處理參數：Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。共破碎４０ ｍｉｎ。

２結果與分析

２．１標準曲線的繪制

標準曲線見圖１。以蛋白質濃度（μｇ／ｍＬ）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得回歸方程：ｙ＝０．００１ ３ｘ＋０．０４５ ９，Ｒ２＝０．９９７。

２．２酶法與反復凍融法相結合的破碎條件研究結果

２．２．１凍融次數對菌體破碎率的影響結果見圖２。由圖２可見，隨著凍融次數的增多，菌體破碎率增加，當反復凍融５次時，破碎率已達９０％，６次時即達１００％。

２．２．２凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖３和圖４。由圖３和圖４可見，反復凍融６次時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度已達到最大。因此反復凍融的次數確定為６次。此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達１．８６ ｇ／Ｌ。

２．３酶法和超聲波法相結合的破碎條件研究結果

２．３．１超聲時間對菌體破碎率的影響結果見圖５。由圖５可見，隨著超聲時間的延長，菌體破碎率增加，當超聲時間達到３０ ｍｉｎ時，菌體破碎率達到１００％。

２．３．２超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖６和圖７。由圖６和圖７可見，超聲時間達３０ ｍｉｎ時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大（１．８３ ｇ／Ｌ），超聲時間進一步延長，ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度不再增加。因此確定超聲破碎時間以３０ ｍｉｎ為宜。

２．４兩種方法的破碎效果比較

反復凍融６次或超聲波破碎３０ ｍｉｎ，細胞破碎率均可達到１００％，此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大，分別為１．８６和１．８３ ｇ／Ｌ。反復凍融法操作較繁瑣，耗時長，需要添加價格昂貴的ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ降解ＤＮＡ及ＲＮＡ以降低破碎液黏度，且每次處理量不能太大；而超聲波破碎時間短、效率高，且對細胞破碎所釋放的ＤＮＡ、ＲＮＡ具有一定剪切作用，破碎同時能有效降低其黏度，綜合考慮選擇超聲波破碎為工程菌細胞破碎條件。

３結論

試驗結果表明，重組血管緊張素轉化酶抑制肽工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎的最優工藝條件為：每克濕菌體重懸于３ｍＬ含有２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ緩沖液中，加溶菌酶至終濃度為２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ后超聲波破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ取上清液。超聲波破碎條件：Ｓｏｎｉｃｓ（ＶＣ×６００型）超聲波破碎儀，Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。此條件下上清液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到１．８３ ｇ／Ｌ。

參考文獻：

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［６］ 劉冬，吳亞麗，張麗君，等．重組降血壓肽基因工程菌破碎方法研究［Ｊ］．河南工業大學學報（自然科學版），２００６，２７（３）：５３－５６．

１．２．４ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的確定根據“１．２．３”所得總蛋白含量及“１．２．２”所得ＧＳＴ－ＡＨＰ含量計算ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度。

１．２．５酶法與反復凍融法相結合破碎菌體發酵液４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，棄上清液收集菌體沉淀，用１×ＰＢＳ緩沖液洗滌２次，稱重記錄濕菌體的質量。按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，冰浴３０ ｍｉｎ后，－７０ ℃冷凍、２５ ℃水浴消融，反復凍融８次。每凍融１次，鏡檢計算破碎率；同時取１ ｍＬ 細胞裂解液，用針筒將２０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００強行注入黏的細胞裂解液中至終濃度為１％，溫和混合３０ ｍｉｎ后，加入ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ至終濃度為５ μｇ／ｍＬ，４ ℃振蕩１０ ｍｉｎ。１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ收集上清液，取１０ μＬ上清液進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。

１．２．６酶法與超聲波法相結合破碎菌體按每克濕菌體加３ ｍＬ含有２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的 １×ＰＢＳ的比例將菌體沉淀重懸，加溶菌酶至終濃度２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ。取２００ ｍＬ酶解液超聲波破碎，每破碎５ ｍｉｎ取樣１次，鏡檢計算破碎率；同時取樣１ ｍＬ，離心收集上清液取１０ μＬ上樣進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測，用Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌ分析，比較不同超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響。超聲波處理參數：Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。共破碎４０ ｍｉｎ。

２結果與分析

２．１標準曲線的繪制

標準曲線見圖１。以蛋白質濃度（μｇ／ｍＬ）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，得回歸方程：ｙ＝０．００１ ３ｘ＋０．０４５ ９，Ｒ２＝０．９９７。

２．２酶法與反復凍融法相結合的破碎條件研究結果

２．２．１凍融次數對菌體破碎率的影響結果見圖２。由圖２可見，隨著凍融次數的增多，菌體破碎率增加，當反復凍融５次時，破碎率已達９０％，６次時即達１００％。

２．２．２凍融次數對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖３和圖４。由圖３和圖４可見，反復凍融６次時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度已達到最大。因此反復凍融的次數確定為６次。此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達１．８６ ｇ／Ｌ。

２．３酶法和超聲波法相結合的破碎條件研究結果

２．３．１超聲時間對菌體破碎率的影響結果見圖５。由圖５可見，隨著超聲時間的延長，菌體破碎率增加，當超聲時間達到３０ ｍｉｎ時，菌體破碎率達到１００％。

２．３．２超聲時間對ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度的影響結果見圖６和圖７。由圖６和圖７可見，超聲時間達３０ ｍｉｎ時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大（１．８３ ｇ／Ｌ），超聲時間進一步延長，ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度不再增加。因此確定超聲破碎時間以３０ ｍｉｎ為宜。

２．４兩種方法的破碎效果比較

反復凍融６次或超聲波破碎３０ ｍｉｎ，細胞破碎率均可達到１００％，此時，上清液中ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到最大，分別為１．８６和１．８３ ｇ／Ｌ。反復凍融法操作較繁瑣，耗時長，需要添加價格昂貴的ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ降解ＤＮＡ及ＲＮＡ以降低破碎液黏度，且每次處理量不能太大；而超聲波破碎時間短、效率高，且對細胞破碎所釋放的ＤＮＡ、ＲＮＡ具有一定剪切作用，破碎同時能有效降低其黏度，綜合考慮選擇超聲波破碎為工程菌細胞破碎條件。

３結論

試驗結果表明，重組血管緊張素轉化酶抑制肽工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＡＨＰ）破碎的最優工藝條件為：每克濕菌體重懸于３ｍＬ含有２ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ的１×ＰＢＳ緩沖液中，加溶菌酶至終濃度為２０ ０００ Ｕ／ｍＬ，室溫放置３０ ｍｉｎ后超聲波破碎３０ ｍｉｎ，４ ℃ １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ取上清液。超聲波破碎條件：Ｓｏｎｉｃｓ（ＶＣ×６００型）超聲波破碎儀，Ф１３ ｍｍ螺紋探頭和Ф１３ ｍｍ螺紋探頭可換尖端，振幅７５％，開５ ｓ，停５ ｓ。此條件下上清液中可溶性ＧＳＴ－ＡＨＰ濃度達到１．８３ ｇ／Ｌ。

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