一株煙草青枯病生防菌的篩選鑒定及其發酵優化

趙曉燕+楊歡+陳建剛+王昌軍+冀志霞+陳守文+

摘要：以煙草青枯病原菌［茄科雷爾氏菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）］為篩選指示菌，采用平板共培養初篩和發酵上清濾液復篩的方法，篩選到煙草青枯病拮抗菌株ＸＬＡ０３，其抑菌圈直徑為１３．７４ ｍｍ；經１６Ｓ ｒＤＮＡ鑒定，菌株ＸＬＡ０３為解淀粉芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。由單因素試驗和正交試驗優化得到了菌株ＸＬＡ０３生物量較高的搖瓶發酵培養基配方為玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１0 ｇ／Ｌ ；培養條件為起始ｐＨ ７．０，接種量１％，裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ。

關鍵詞： 煙草青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）；解淀粉芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；篩選；發酵優化

中圖分類號：S435.72；TQ458文獻標識碼：Ａ文章編號：０４３９－８１１４（２０１４）０８－1810－０5

Screening and Fermentation Optimization of Antagonistic Bacillus against Tobacco Bacterial Wilt

ZHAO Xiao-yan1,YANG Huan2, CHEN Jian-gang1,WANG Chang-jun3, JI Zhi-xia1, CHEN Shou-wen1

(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070, China;2. Wuhan Leyang Biotechnology Co., Ltd.， Wuhan 430071, China;3. Hubei Tobacco Research Institute, Wuhan 430030, China)

Abstract: One bacterial strain was screened ｆｏｒ ｉｔｓ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｔｈｅ ｄｕａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｉｌｔｒａｔｅ ｔｅｓｔｓ，ａｎｄ ｎａｍｅｄ ａｓ ＸＬＡ０３． Ｉｔｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｃｉｒｃｌｅ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １３ ｍｍ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ＸＬＡ０３ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ， ａｎ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｔｓ ｂｉｏｍａｓｓ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｌａｓｋｓ ｗａｓ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈ １５．０ ｇ／Ｌ， ｓｏｙｂｅａｎ ｍｅａｌ ５０．０ ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１ ｇ／Ｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ７．０， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｉｚｅ ｏｆ １％ ｌｏａｄｅｄ ｌｉｑｕｉｄ ｏｆ ２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｂａｃｃｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗｉｌｔ； Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

煙草青枯病［病原物為茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）］是一種典型的維管束病害，最顯著的發病癥狀是煙草植株出現枯萎現象，危害期大多出現在煙草旺長期或者旺長期以后，根、莖、葉部均會受害［1，2］。經常發病產煙區的老病田或旱地煙田幾乎每年都會發生，形成絕產無收和全田發病的現象，造成大面積煙草產量、品質下降，制約著煙草產業的發展［3］。目前防治煙草青枯病的方法主要包括化學防治、生物防治、加強栽培管理和選用優質的抗病品種［4-7］，但這些方法均無法杜絕該病的發生。生產過程中一般以種植抗性煙草品種和輪作為基礎，同時加強大田栽培管理，通過化學藥物輔助保護的綜合防治技術控制病害發生。由于消費者對煙草品質的要求逐步提高，對煙草成熟期病害的防治不宜采用有殘留的化學藥劑，而使用拮抗細菌防治植物病害能達到無公害防治的目的［8，9］。

國內外關于拮抗細菌防治植物青枯病的報道涉及的生防細菌主要有芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等。其中芽孢桿菌是一類好氧和兼性厭氧微生物，所產芽孢抗逆能力強、繁殖速度快、營養要求簡單，易在植物表面定殖。由于其芽孢生命力強，有利于生防制劑的生產和儲存［10］。國內學者相繼發現一些芽孢桿菌對煙草青枯病菌具有拮抗作用，尹華群等［11］從煙草健株中分離得到對煙草青枯菌有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌菌株001、短芽孢桿菌菌株009 和011；彭細橋等［12］從湖南桂陽煙草青枯病重病區采集的煙草健株上分離篩選出有強拮抗作用的枯草芽孢桿菌H-1、短芽孢桿菌H-9和H-11。關于煙草青枯病的拮抗芽孢桿菌的研究主要集中在拮抗機制、通過優化培養條件提高其抑菌活性［13］方面，鮮見關于通過優化拮抗菌株的發酵培養條件提高其生物量的報道。

在農業生產應用中，芽孢菌劑具有易儲藏、復活性高的優點。在芽孢桿菌發酵過程中，芽孢產生的情況受營養和培養環境影響較大，不同菌株的芽孢產生的條件也不同。本研究對影響生防菌XLA03生長的培養基的成分和培養條件進行了篩選和優化，為獲得高濃度、高活性的芽孢用于制備生防菌制劑防治煙草青枯病奠定基礎。

1材料與方法

1.1 供試材料

煙草青枯病菌為溫室煙株葉片強致病力菌株；煙草及煙草根際土壤從湖北省恩施州咸豐縣、恩施市盛家壩和下云壩等種植區域隨機取點采樣獲得。NA培養基、NB培養基、蛋白培養基、纖維素培養基、幾丁質培養基、PDA培養基參照文獻［14］的方法配制。

1.2煙草青枯病拮抗菌的分離和篩選

煙草葉、莖、根經常規表面消毒后，選擇表面無病的樣品在研缽中研磨，將組織液涂布于NA平板上。同時將少量煙株根際土壤加入有玻璃珠的無菌生理鹽水中，振蕩搖勻后稀釋涂布于NA平板上進行分離純化，將分離純化獲得的菌株進行編號。

采用平板共培養篩選［15］和發酵液上清濾液復篩。用煙草青枯病菌作指示菌初步測定拮抗能力，28～30 ℃正置培養2～3 d后觀察抑菌圈，根據抑菌圈的有無和大小判斷拮抗能力強弱。復篩時含菌培養基平板吹干后用打孔器打孔，試驗菌菌液通過無機濾膜過濾，取50 μL濾液注入孔中，28～30 ℃正置培養2～3 d后觀察抑菌圈。

1.3菌株的形態觀察及部分生理生化指標測定

以實驗室保存的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）P1（11079）菌株為參照，菌株XLA03的生理生化鑒定參照《伯杰氏系統細菌學手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》。

1.416S rDNA序列相似性分析

提取試驗菌株XLA03的16S rDNA進行基因擴增［16］。純化后的產物測序由北京奧科生物技術有限責任公司利用ABI3730XL自動測序儀完成。菌株XLA03的16S rDNA基因測序結果用NCBI的Blast軟件進行序列相似性分析。從GenBank數據庫和核糖體數據庫中選取相近種屬的代表性菌株的16S rDNA基因序列，通過Clustal 1.8 和MEGA 4.0軟件進行系統發育分析，構建基于16S rDNA基因序列的系統發育樹。

1.5培養基成分的優化

1.5.1單因素優化 分別將出發培養基（NB培養基）中的碳源（葡萄糖）依次替換為玉米淀粉、蔗糖、 乳糖、麥芽糖； 氮源（牛肉膏）依次替換為玉米漿、大豆餅粉、豆粕、酵母粉； 無機鹽（氯化鈉）依次替換為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳。通過拮抗菌的生物量來確定最佳碳源、 氮源和無機鹽。

確定最佳碳源、 氮源和無機鹽后，根據拮抗菌的生物量進一步優化培養基，最終確定最佳碳源、氮源和無機鹽的濃度范圍。

1.5.2正交優化試驗培養基成分的正交優化試驗是根據單因素的優化結果，選擇玉米淀粉、豆粕、 磷酸氫二鉀、硫酸錳作為培養基的碳源、氮源和無機鹽，每個因素選3個最佳的用量水平，采用正交表進行正交試驗，根據生物量的情況確定最佳的培養基配方。

培養條件的正交優化試驗的因素設計以前期研究為依據。選擇起始pH、裝液量、接種量為因素，每個因素選3個不同水平，進行正交試驗，根據生物量的大小確定優化的培養條件。

2結果與分析

2.1煙草青枯病拮抗菌的分離和篩選

從恩施4個煙草種植區域共采集樣品48份，分離得到192株細菌，初篩得到拮抗菌24株，復篩發現其中4株拮抗作用明顯，抑菌圈達到10 mm以上，具體情況見表1。其中下云壩健康煙草葉片中分離的菌株XAL03的抑菌圈最大，直徑達到13.74 mm，確定菌株XAL03對青枯病菌拮抗作用最強，將其作為試驗菌進行后續試驗。

2.2拮抗菌株XAL03的生理生化檢測

拮抗菌XAL03在LB平板上培養24 h，形成的單菌落類似圓形，邊緣不規則，有隆起，表面皺褶，不透明，干燥，菌落近白色。菌株XAL03的形態、生理生化特征（表2）與Bacillus amyloliquefaciens P1接近。

2.3系統發育分析

提取拮抗菌株XAL03的16S rDNA進行基因測序，將核酸序列提交到NCBI的GenBank數據庫進行同源性比對（Blastn）。結果顯示，菌株XAL03的序列和Bacillus amyloliquefaciens（AB255629）的序列相似性達到99.73%。選取同源性97%以上相近種屬菌株的16S rDNA基因序列進行比對，構建系統發育樹，結果見圖1。菌株XAL03同解淀粉芽孢桿菌屬于同一個聚類。

2.4菌株XLA03的培養基優化

2.4.1單因素優化 以NB培養基為基礎培養基 （CK）， 對碳源、氮源、無機鹽進行單因素等量替代，通過發酵培養測定XAL03的生物量。在相同條件下培養48 h后進行比較，不同碳源和氮源條件下XAL03生長情況也就不一樣（表3）。XAL03生物量由大到小所對應的碳源分別為玉米淀粉 、麥芽糖、乳糖 、蔗糖、CK，生物量由大到小所對應的氮源分別為豆粕、玉米漿 、大豆餅粉、 酵母粉 、CK。以玉米淀粉為碳源時，其培養液的OD600 nm達到3.57，以豆粕為氮源時OD600 nm達到11.57，因此，確定生物量達到最大的玉米淀粉和豆粕分別作為后續試驗的碳源和氮源。對最佳碳源、氮源分別設置不同用量進行XAL03發酵培養，比較生物量大小。結果（表4）表明，玉米淀粉用量40 g/L、豆粕用量20 g/L時發酵液中XAL03的生物量達到最大。

設置不同磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳含量的培養基，發酵培養48 h后分別測定XAL03的生物量。結果（表5）表明，磷酸氫二鉀用量1.5 g/L、硫酸鎂用量0.75 g/L、硫酸錳用量0.010 g/L時，菌體的生物量達到最大值。

2.4.2培養基配方和培養條件正交試驗優化為了進一步對發酵培養基配方進行優化，采用Minitab 15.0軟件設計培養基配方的4因素3水平正交試驗（表6），考察培養基配比對生物量的影響。結果見表7。

由表7可見，各因素影響XAL03生物量的主次順序為B、D、A、C，最優組合為A3B3C2D1。結合“2.4.1”的試驗結果，最終得到優化的培養基各成分用量為玉米淀粉 15.0 g/L、豆粕50.0 g/L、K2HPO4·3H2O 1.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、MnSO4·H2O 0.010 g/L。

培養條件的優化選擇起始pH、接種量和裝液量（250 mL三角瓶）進行正交試驗（表8），結果見表9。由表9可知，各因素影響XAL03生物量的主次順序為B、C、A，最優組合為A1B2C1。由正交試驗結果得到優化的培養條件為起始pH 7.0、接種量5%、裝液量20 mL/250 mL。在優化的發酵培養基和發酵條件下，解淀粉芽孢桿菌XAL03生物量最高，為150.50×108 CFU/mL。

3小結與討論

用煙草青枯病菌作初步拮抗測定，根據抑菌圈篩選出拮抗能力較強的菌株XAL03，對其生理生化指標和16S rDNA序列進行分析，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

生防菌制劑的規模生產往往需要考慮成本因素。對于培養基的選擇應該遵循原料來源豐富、價格低廉的原則。通過單因素試驗和正交試驗相結合，得到了生物量較高的培養基配方為玉米淀粉 １５．０ ｇ／Ｌ、豆粕５０．０ ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ １．０ ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．７５ ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０１０ ｇ／Ｌ；優化得到發酵條件為接種量５％、初始ｐＨ ７．０、裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ，ＸＡＬ０３的生物量為１５０.50×１０8 ＣＦＵ／ｍＬ。后續研究得到最優發酵條件為接種量１％、初始ｐＨ ７．０、裝液量２０ ｍＬ／２５０ ｍＬ， 在此條件下，芽孢形成達９４％以上，生物量比出發培養基提高了６．０倍，達到１．０７×１０１０ ＣＦＵ／ｍＬ。

拮抗微生物能夠在葉圍及根際生存、定殖，在植物體表占據有利的空間，與病原物進行空間及營養的競爭，同時還能分泌拮抗物質，如幾丁質酶、抗生素、細菌毒素等，這些物質能抑制甚至殺死病原菌［１７，１８］，菌株ＸＡＬ０３的生防機理還有待進一步研究。本研究篩選出解淀粉芽孢桿菌ＸＡＬ０３在煙草青枯病的防治中存在潛在的重大應用價值，優化后的培養基配方對其生物菌劑的生產具有重要意義。

參考文獻：

［１］ 徐樹德，尚志強，秦西云．煙草青枯病研究進展［Ｊ］．天津農業科學，２０１０，１６（４）：４９－５３．

［２］ ＧＥＮＩＮ Ｓ， ＢＯＵＣＨＥＲ Ｃ． Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ： Ｓｅｃｒｅｔｓ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｕｎｖｅｉｌｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｅ ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００２， ３（３）： １１１－１１８．

［３］ 肖田，姚廷山．煙草青枯病的發生特點與綜合防治技術［Ｊ］．云南農業科技，２００８（１）：５６－５８．

［４］ 徐輝，熊霞．煙草青枯病防治技術研究進展［Ｊ］．湖南農業科學，２００９（４）：９１－９３．

［５］ ＬＥＭＥＳＳ Ｆ， ＺＥＬＬＥＲ Ｗ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ Ｅｔｈｉｐｉａ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２００７， ４２（３）： ３３６－３４４．

［６］ ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ， ＳＴＡＢＢ Ｅ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９９６， ８： １８５５－１８６９．

［７］ ＦＲＡＶＥＬＤ． Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， ２００６， ４４： ３３７－３５９．

［８］ 陳瑞泰．煙草病蟲害防治［Ｍ］．濟南：山東科學技術出版社，１９８９．

［９］ 霍沁建，張深，王若焱．煙草青枯病研究進展［Ｊ］．中國農學通報，２００７，２３（８）：３６４－３６８．

［１０］ ＥＭＭＥＲＴ Ｅ Ａ， ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａ（Ｇｒａｍ－）ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１７１（１）：１－９．

［１１］ 尹華群，易有金，羅 寬，等． 煙草青枯病內生拮抗細菌的鑒定及小區防效的初步測定［Ｊ］．中國生物防治，２００４，２０（３）：２１９－２２０．

［１２］ 彭細橋，劉紅艷，羅 寬，等．煙草內生青枯病拮抗細菌的篩選和初步鑒定［Ｊ］．中國煙草科學，２００７，２８（２）：３８－４０．

［１３］ 程洪斌，劉曉橋，陳紅漫． 枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進展［Ｊ］．上海農業學報，２００６，２２（１） ：１０９－１１２．

［１４］ ＭＯＨＳＩＮ Ｔ， ＹＡＳＭＩＮ Ｓ， ＦＡＵＺＩＡ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｂｌａｃｋ ｓｃｕｒｆ ｂｙ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｉｃｂｉｏｌ，２０１０，４１（２）：４３９－４５１．

［１５］ 方中達．植病研究方法 ［Ｍ］．第三版．北京：中國農業出版社，１９９８．

［１６］ ＬＩ Ｘ， ＺＨＡＮＧ Ｄ， ＣＨＥＮ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ. ａ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｂｉｏｌ， ２００４， ５４： ２１３１－２１３６．

［１７］ 梅汝鴻．植物微生態制劑——增產菌［Ｍ］．北京：農業出版社，１９９１．

［１８］ ＡＮＤＲＥＷＳ Ｊ Ｈ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， １９９２， ３０： ６０３－６３５．

［２］ ＧＥＮＩＮ Ｓ， ＢＯＵＣＨＥＲ Ｃ． Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ： Ｓｅｃｒｅｔｓ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｕｎｖｅｉｌｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｅ ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００２， ３（３）： １１１－１１８．

［３］ 肖田，姚廷山．煙草青枯病的發生特點與綜合防治技術［Ｊ］．云南農業科技，２００８（１）：５６－５８．

［４］ 徐輝，熊霞．煙草青枯病防治技術研究進展［Ｊ］．湖南農業科學，２００９（４）：９１－９３．

［５］ ＬＥＭＥＳＳ Ｆ， ＺＥＬＬＥＲ Ｗ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ Ｅｔｈｉｐｉａ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２００７， ４２（３）： ３３６－３４４．

［６］ ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ， ＳＴＡＢＢ Ｅ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９９６， ８： １８５５－１８６９．

［７］ ＦＲＡＶＥＬＤ． Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， ２００６， ４４： ３３７－３５９．

［８］ 陳瑞泰．煙草病蟲害防治［Ｍ］．濟南：山東科學技術出版社，１９８９．

［９］ 霍沁建，張深，王若焱．煙草青枯病研究進展［Ｊ］．中國農學通報，２００７，２３（８）：３６４－３６８．

［１０］ ＥＭＭＥＲＴ Ｅ Ａ， ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａ（Ｇｒａｍ－）ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１７１（１）：１－９．

［１１］ 尹華群，易有金，羅 寬，等． 煙草青枯病內生拮抗細菌的鑒定及小區防效的初步測定［Ｊ］．中國生物防治，２００４，２０（３）：２１９－２２０．

［１２］ 彭細橋，劉紅艷，羅 寬，等．煙草內生青枯病拮抗細菌的篩選和初步鑒定［Ｊ］．中國煙草科學，２００７，２８（２）：３８－４０．

［１３］ 程洪斌，劉曉橋，陳紅漫． 枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進展［Ｊ］．上海農業學報，２００６，２２（１） ：１０９－１１２．

［１４］ ＭＯＨＳＩＮ Ｔ， ＹＡＳＭＩＮ Ｓ， ＦＡＵＺＩＡ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｂｌａｃｋ ｓｃｕｒｆ ｂｙ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｉｃｂｉｏｌ，２０１０，４１（２）：４３９－４５１．

［１５］ 方中達．植病研究方法 ［Ｍ］．第三版．北京：中國農業出版社，１９９８．

［１６］ ＬＩ Ｘ， ＺＨＡＮＧ Ｄ， ＣＨＥＮ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ. ａ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｂｉｏｌ， ２００４， ５４： ２１３１－２１３６．

［１７］ 梅汝鴻．植物微生態制劑——增產菌［Ｍ］．北京：農業出版社，１９９１．

［１８］ ＡＮＤＲＥＷＳ Ｊ Ｈ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， １９９２， ３０： ６０３－６３５．

［２］ ＧＥＮＩＮ Ｓ， ＢＯＵＣＨＥＲ Ｃ． Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ： Ｓｅｃｒｅｔｓ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｕｎｖｅｉｌｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｏｍｅ ［Ｊ］． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２００２， ３（３）： １１１－１１８．

［３］ 肖田，姚廷山．煙草青枯病的發生特點與綜合防治技術［Ｊ］．云南農業科技，２００８（１）：５６－５８．

［４］ 徐輝，熊霞．煙草青枯病防治技術研究進展［Ｊ］．湖南農業科學，２００９（４）：９１－９３．

［５］ ＬＥＭＥＳＳ Ｆ， ＺＥＬＬＥＲ Ｗ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ ｉｎ Ｅｔｈｉｐｉａ［Ｊ］． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ， ２００７， ４２（３）： ３３６－３４４．

［６］ ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ， ＳＴＡＢＢ Ｅ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １９９６， ８： １８５５－１８６９．

［７］ ＦＲＡＶＥＬＤ． Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， ２００６， ４４： ３３７－３５９．

［８］ 陳瑞泰．煙草病蟲害防治［Ｍ］．濟南：山東科學技術出版社，１９８９．

［９］ 霍沁建，張深，王若焱．煙草青枯病研究進展［Ｊ］．中國農學通報，２００７，２３（８）：３６４－３６８．

［１０］ ＥＭＭＥＲＴ Ｅ Ａ， ＨＡＮＤＥＬＳＭＡＮ Ｊ． Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ： Ａ（Ｇｒａｍ－）ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，１７１（１）：１－９．

［１１］ 尹華群，易有金，羅 寬，等． 煙草青枯病內生拮抗細菌的鑒定及小區防效的初步測定［Ｊ］．中國生物防治，２００４，２０（３）：２１９－２２０．

［１２］ 彭細橋，劉紅艷，羅 寬，等．煙草內生青枯病拮抗細菌的篩選和初步鑒定［Ｊ］．中國煙草科學，２００７，２８（２）：３８－４０．

［１３］ 程洪斌，劉曉橋，陳紅漫． 枯草芽孢桿菌防治植物真菌病害研究進展［Ｊ］．上海農業學報，２００６，２２（１） ：１０９－１１２．

［１４］ ＭＯＨＳＩＮ Ｔ， ＹＡＳＭＩＮ Ｓ， ＦＡＵＺＩＡ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｂｌａｃｋ ｓｃｕｒｆ ｂｙ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ［Ｊ］． Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｉｃｂｉｏｌ，２０１０，４１（２）：４３９－４５１．

［１５］ 方中達．植病研究方法 ［Ｍ］．第三版．北京：中國農業出版社，１９９８．

［１６］ ＬＩ Ｘ， ＺＨＡＮＧ Ｄ， ＣＨＥＮ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｉｎｇａｐｏｒｅｎｓｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ. ａ ｎｏｖｅｌ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ［Ｊ］． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｂｉｏｌ， ２００４， ５４： ２１３１－２１３６．

［１７］ 梅汝鴻．植物微生態制劑——增產菌［Ｍ］．北京：農業出版社，１９９１．

［１８］ ＡＮＤＲＥＷＳ Ｊ Ｈ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］． Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ， １９９２， ３０： ６０３－６３５．