啤酒酵母Ⅲ號染色體ARS305附近核小體的定位

吳亞坤+杜志強+王建英

摘要：以微球菌核酸酶法分離的啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）染色體單核小體DNA為模板進行PCR，根據不同靶序列PCR產物拷貝數的不同定位核小體位置。結果表明，啤酒酵母Ⅲ號染色體ARS305附近核小體位置大約在39107位到39269位、39318位到39470位及39540位到39694位之間，理論計算結果與試驗結果基本一致。

關鍵詞：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；核小體；定位；Ⅲ號染色體；自主復制序列305

中圖分類號：Q34；Q949.326.1文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０14）08－1928-02

Location of Nucleosome around ARS305 on Chromosome III of Saccharomyces cerevisiae

WU Ya-kun，DU Zhi-qiang，WANG Jian-ying

（The Institute of Bioengineering and Technology，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010，Inner Mongolia，China）

Abstract: Using the variation pattern of ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ of ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ was determined ｗｈｅｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｍｏｎｏ－ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ ＤＮＡ ｏｆ Sａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｂｙ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ was used ａｓ ｔｈｅ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ． The results ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ were ｔｈｒｅｅ ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ ａｒｏｕｎｄ ＡＲＳ３０５ of chromosome Ⅲ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ３９１０７－ ３９２６９ ｂｐ， ３９３１８－３９４７０ ｂｐ， ａｎｄ ３９５４０－ ３９６９４ ｂｐ． Cｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ｉｎ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄａｔａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ； ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ； location； ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＩＩＩ； ＡＲＳ３０５

真核生物的染色質以組蛋白八聚體和緊密纏繞其上147 bp的DNA片段為基本組成結構單元，由于核小體在DNA分子上的可移動性，相鄰核小體之間的自由DNA片段長度從10 bp至100 bp不等［1］。在研究啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）DNA分子復制過程中，發現許多具有自主復制活性的序列。試驗研究表明，在自主復制序列（Autonomous replicating sequence，ARS）附近通常為核小體缺乏區域，而啤酒酵母Ⅲ號染色體具有強復制起始活性的ARS305及其附近區域卻有相對穩定的核小體占據信號［2］。本研究從理論預測和試驗驗證兩方面來研究ARS305附近的核小體占據情況，為后續研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

啤酒酵母由內蒙古科技大學生物工程與技術研究所分子生物學實驗室低溫保存。

1.2方法

1.2.1引物設計從SGD網站獲取啤酒酵母染色體ⅢARS305的基因序列（39159-39706），并依前后延伸后序列（39032-39761）設計15對PCR引物。

1.2.2單核小體DNA提?、贀u菌。挑取單菌落接種于2 mL YPD培養基中，30 ℃、200 r/min過夜振蕩培養。②擴大培養。取過夜培養物按1∶50（V/V）擴大培養至OD600 nm為0.9。③收集菌體。加入2%的甲醛交聯細胞作用30 min，然后用125 mmol/L的甘氨酸使反應猝熄， 4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集細胞，并用20 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖液清洗菌體1次。④原生質體提取。將菌體重懸于6 mL A液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、1 mol/L D-山梨醇、10 mmol/L β-巰基乙醇）中，加入終濃度為0.25 mg/mL的酵母裂解酶裂解細胞［3］，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min收集細胞后，重懸于2 mL B液（1 mol/L D-山梨醇、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、0.075% Nonidet P40、1 mmol/L β-巰基乙醇和500 μmol/L亞精胺）中。⑤單核小體提取。將上述原生質體溶液分裝為每份200 μL，用微球菌核酸酶充分消化后，加入新配制的C液（5% SDS、50 mmol/L EDTA ）終止反應。然后用蛋白酶K法提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收單核小體DNA混合物。

1.2.3PCR定位核小體以單核小體DNA混合物為模板，用15對引物進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，試驗結果同Kaplan等［4］的試驗數據和理論預測結果［5］對比。

2結果與分析

2.1單核小體DNA提取結果

啤酒酵母菌染色質用微球菌核酸酶處理后，瓊脂糖凝膠電泳顯示單核小體DNA中含有少量全基因組DNA（圖1），切膠回收單核小體DNA混合物（圖2）。

2.2PCR擴增定位核小體結果

以單核小體DNA混合物為模板，用15對引物進行PCR擴增，結果如圖3所示。由圖3可以看出，泳道2、3、4、7、8、9、12、13、14電泳條帶明顯，可推測引物P2/P2和P4/P4之間，P7/P7和P9/P9之間以及P12/P12和P14/P14之間對應的區域可能被核小體占據，對應于Ⅲ號染色體上的堿基位置為39107位到39269位以及39318位到39470位和39540位到39694位。Kaplan等［4］試驗結果表明，在39089（67）位到39258（227）位之間以及39350（319）位到39518（487）位之間和39598（567）位到39750（719）位之間可能存在核小體。

本研究中理論預測結果為在39096（65）位到39296（231）位之間以及39323（292）位到39481（456）位和39580（549）位到39744（713）位之間可能存在核小體。試驗實際中檢測出的核小體與理論預測及Kaplan等［4］試驗結果基本一致。

3小結與討論

核小體定位技術起源于20世紀80年代，隨著基因芯片技術的發展而不斷地完善。近年來，隨著計算機技術在生物學的廣泛應用，利用計算機編程，通過全基因組測序對一維堿基序列的分子結構特性分析，從而從理論上預測核小體位置的方法得到了快速的發展，已經逐漸形成了一套芯片檢測-理論預測-試驗驗證的成熟試驗體系［6-8］，為研究染色質結構特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯關系開辟了道路。本試驗研究了啤酒酵母Ⅲ號染色體ARS305附近的核小體定位情況，進一步確定了ARS305作為具有強起始活性的自主復制區域的特殊性。

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3小結與討論

核小體定位技術起源于20世紀80年代，隨著基因芯片技術的發展而不斷地完善。近年來，隨著計算機技術在生物學的廣泛應用，利用計算機編程，通過全基因組測序對一維堿基序列的分子結構特性分析，從而從理論上預測核小體位置的方法得到了快速的發展，已經逐漸形成了一套芯片檢測-理論預測-試驗驗證的成熟試驗體系［6-8］，為研究染色質結構特性與生物遺傳信息傳遞之間的耦聯關系開辟了道路。本試驗研究了啤酒酵母Ⅲ號染色體ARS305附近的核小體定位情況，進一步確定了ARS305作為具有強起始活性的自主復制區域的特殊性。

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