人腦膠質瘤組織中微小RNA-21與磷酸酶和張力蛋白同源基因的表達及其臨床意義

薛飛 沈照立 沈睿 陳先震

[摘要] 目的 初步探索microRNAR-21（miR-21）與磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（PTEN）基因在人腦膠質瘤中的表達及其臨床意義。 方法 采用RT-PCR檢測215例膠質瘤（膠質瘤組）和50例正常人腦組織（對照組）中miRNA-21的表達水平，采用SP免疫組化法檢測PTEN蛋白的表達情況，并探討二者在膠質瘤組織中表達的相關性。 結果 miR-21在膠質瘤組中的相對表達量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明顯高于對照組織（1.064±0.126），差異有統計學意義（P < 0.05）。PTEN在對照組中的表達率（100.00%）高于膠質瘤組（49.30%），差異有統計學意義（P < 0.05）。膠質瘤組中miR-21的表達量與PTEN在膠質瘤組中的陽性表達率呈負相關（r=-0.448，P < 0.05）。 結論 miR-21在膠質瘤組織中的表達升高，可能通過負性調節PTEN的表達，在膠質瘤的發生發展中發揮作用，二者的表達可以顯示膠質瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質瘤中的表達有助于評價膠質瘤的惡性程度和生物學行為。

[關鍵詞] microRNAR-21；磷酸酶和張力蛋白同源蛋白；腦膠質瘤；相關性

[中圖分類號] R739.41[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-7210（2014）04（c）-0036-04

Expression of micro RNA-21 and phosphatase and tensin homology gene in glioma and their clinical significances

XUE Fei SHEN Zhaoli SHEN Rui CHEN Xianzhen

Department of Neurosurgery, the 10th People's Hospital Afflilated to Tongji University, Shanghai 200072, China

[Abstract] Objective To investigate the expression of microRNAR-21 (miR-21) and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) in glioma and their clinical significances. Methods The expression of miR-21 was detected by RT-PCR in 215 glioma (glioma group) and 50 cases of normal brain tissues (control group). S-P immunohistochemical was used to detect the expression of PTEN. Results The expression of miR-21 (2-ΔΔCT) in the glioma group was (4.222±1.755), which was significantly higher than that in the control group (1.064±0.126), the difference was statistically significant (P < 0.05). The positive rate of PTEN protein in glioma group (49.30%) was lower than that in control group (100.00%), the difference was statistically significant (P < 0.05). There was negative correlation between miR-21 and the positive ratio of PTEN (r=-0.448, P < 0.05). Conclusion miR-21 might play an important role in the down-regulation of PTEN and development of glioma, the expression of two show the m alignant degree of glioma, it is helpfal to evaluate the m alignant degree and biologic behavior of glioma by detecting both expression.

[Key words] miR-21; PTEN; Glioma; Correlation

微小RNA（microRNA）是真核生物中一種長度約為20~22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過特異性識別并結合靶mRNA的3'非編碼區（3'UTR）使靶mRNA降解，發揮其對基因的轉錄后調控，在細胞的生長、分化、凋亡及代謝等活動中發揮著重要作用[1]。最近幾年的研究發現，MicroRNA在腫瘤的發生、發展和轉移中同樣起到非常重要的作用[2]，并有大量實驗證據表明，微小RNAR-21（miR-21）在結腸癌、乳腺癌和膀胱癌等腫瘤細胞中的表達都表現出顯著異常[3-5]，在膠質瘤表達的microRNA中，miR21表達水平升高最為明顯[6]。通過計算機預測軟件并經實驗證實的miR21的靶基因包括：張力蛋白同源（PTEN）、PDCD4、RECK、TIMP3、Fasl、TRIP、Tap6、HNRPK及Spry2， 這些基因都發揮著抑制腫瘤生長的作用[7]。其中，磷酸酶和PTEN基因是具有磷酸酶活性的抑癌基因，其基因突變或缺失與多種惡性腫瘤密切相關[8]。miR21對PTEN的直接調控作用已經在膠質瘤、膀胱癌和胰腺癌中得到證實。目前尚沒有對miR21和PTEN二者在膠質瘤中的表達相關性報道，考慮到miR21和PTEN在腫瘤發生發展中的重要作用，研究二者在膠質瘤組織中的表達及二者的相關性，為探討miR21和PTEN作為腫瘤標志物的可能性提供重要依據，并為膠質瘤的診斷、治療提供新的途徑和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008~2012年同濟大學附屬第十人民醫院（以下簡稱“我院”）神經外科膠質瘤患者手術切除的膠質瘤石蠟包埋組織標本215例為膠質瘤組，其中男118例，女97例，男女比例1.21∶1；年齡6~70歲，平均（47.50±2.21）歲。選擇同期行腦外傷減壓術的腦組織50例為對照組，其中男女比例為1.19∶1；年齡8~69歲，平均（46.30±2.03）歲。病例組與對照組年齡和性別差異無統計學意義（P < 0.05），具有可比性。所有患者均為原發，有詳細的臨床資料和手術記錄，無其他嚴重并發癥，且所有患者均為第一次手術治療，術前均未行放、化療及免疫治療。所有患者或家屬知情同意并簽署知情同意書，本研究經過我院倫理委員會通過。

1.2 實驗試劑

Trizol購自美國Invitrogen公司；miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒及miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購于北京天根生物技術有限公司；引物由上海生工生物技術有限公司合成；SP試劑盒、DAB試劑盒、蘇木精染液及鼠抗人PTEN單克隆抗體均購自上海生工生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織總RNA提取用眼科剪將存于-80℃的組織剪碎，加入1 mL Trizol（將樣品完全覆蓋為宜），按照Trizol說明書提取組織中總RNA。應用NANO-DROP 2000超微量分光光度計進行檢測，選擇OD260/280為1.8~2.0的RNA于-80℃保存備用。

1.3.2 RT-PCR檢測膠質瘤組織中miR-21的表達量取總RNA 0.5 μg，應用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，37℃反應60 min，-80℃備用。PCR擴增采用天根生物技術有限公司提供的miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進行，上游引物根據試劑盒提供的設計方法進行設計，miR21的上游引物為：5'-GCGGTAGCTTATCAGACTGA-3'，內參U6的上游引物序列為：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物由試劑盒提供。PCR擴增條件為：94℃ 2 min，40個循環：94℃，20 s，60℃，35 s。每個反應設三個復孔，記錄每個反應的CT值，實驗結果采用2-ΔΔCT表示膠質瘤組織中miR-21相對于正常人腦組織的表達倍數（相對表達量），其中△△CT=膠質瘤組織（CTmiR-21-CTU6）-正常腦組織（CTmiR-21-CTU6）。

1.3.3 SP法檢測膠質瘤組織中PTEN的表達采用SP法進行PTEN檢測，操作流程按照試劑盒說明書進行，用PBS作為陰性對照，已知PTEN陽性表達的膠質瘤標本作為陽性對照。PTEN陽性表達細胞均為細胞核或胞漿著色，呈棕黃色或黃褐色均勻顆粒狀。在高倍顯微鏡下，每張切片均選擇5個視野膠質瘤細胞密集區域進行觀察，每個視野內計數100個膠質瘤細胞，陽性細胞數≥ 50%為強陽性（+++），25%~＜ 50%為陽性（++），5%~＜ 25%為弱陽性（+），＜ 5%為陰性（-）。陽性率=（各組總例數-陰性細胞數）/各組總例數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關分析miR21與PTEN表達量的相關性，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-21在膠質瘤組織和正常組織中的表達

膠質瘤組中miR-21的相對表達量（2-ΔΔCT）（4.222±1.755）明顯高于正常腦組織的對照組（1.064±0.126），差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

表1 兩組miR-21的表達情況（x±s）

2.2 PTEN在膠質瘤組織和正常腦組織中的表達

膠質瘤組中PTEN的表達率為49.30%，正常腦組織的對照組中PTEN的表達率為100.00%，PTEN在膠質瘤組中的表達率明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 兩組磷酸酶和張力蛋白同源基因的表達率情況

2.3 膠質瘤組織中miR-21與PTEN表達的相關性

對215例膠質瘤組中miR-21和PTEN的相對表達情況進行相關性分析，結果顯示，膠質瘤組織中miR-21與PTEN的陽性表達呈負相關（r=-0.448，P < 0.05）。見表3。

表3 miR-21與PTEN在人腦膠質瘤組織中的表達相關性

注：PTEN：張力蛋白同源蛋白

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，約占顱內腫瘤的46%，惡性膠質瘤的發生率為（5~8）/10萬[9]。膠質瘤呈浸潤性生長，沒有明顯界限，手術無法完全切除。放療、化療不能特異性殺死膠質瘤細胞，并且對神經系統有嚴重的毒副作用。膠質瘤是神經外科領域的難題之一，至今沒有突破性進展，且對其發生發展了解不夠透徹。因此，闡述其致病機制、尋找新的治療手段，對于攻克膠質瘤非常重要。

miR-21在多種惡性腫瘤中表達均升高，這些腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝癌及宮頸癌，并通過調節抑癌基因或細胞分化、凋亡相關的基因而促進腫瘤的發生發展。已經在膠質瘤鑒定出表達量恒定改變的miRNA，其中最顯著的是miR-21。miR-21調控腫瘤生長機制的研究取得了一些進展，其中，miR-21在人乳腺癌細胞系MCF-7中通過調控程序性細胞死亡基因-4（PDCD4）抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖[10]。通過篩選人結腸癌miRNA表達譜中過表達的miRNA，發現miR-21的過表達和淋巴結轉移程度高度相關[11]。PTEN是磷酸酶家族中發現的第一個有抑癌作用的基因，具有雙磷酸酶活性，在細胞的遷移、黏附及胚胎正常發育中發揮重要的生物學功能，并在抑制腫瘤生長中也發揮重要作用。

Huang等[12]運用實時定量PCR和免疫組織化學染色，分析并對比了miR-21和PTEN蛋白在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達情況，研究結果表明miR-21在乳腺癌組織中表達水平高于對照組，而PTEN在正常乳腺組織中的表達水平高于乳腺組織中，并且miR-21與PTEN蛋白的表達在乳腺癌組織中呈負相關。有研究發現，miR-21在肝細胞癌組織及細胞株中均呈高表達；體外培養肝細胞癌細胞，敲低miR-21的表達后檢測發現PTEN蛋白，發現其表達量增加，而肝癌細胞的增生、轉移及侵襲能力卻降低，可見PTEN作為miR-21的靶基因，其表達與miR-21呈負相關，在腫瘤細胞的增殖、侵襲中發揮重要最用[10]。以上研究表明，在肝癌和乳腺癌中PTEN是miR-21的靶基因，然而Hatley等[13]卻認為在非小細胞肺癌中PTEN并不是miR-21的靶標，可見人們對于腫瘤中miR-21與PTEN的關系仍未達成共識。

本研究通過RT-PCR技術檢測215例膠質瘤患者中miR-21的表達量，發現miR-21在膠質瘤組織中的表達顯著高于正常腦組織。膠質瘤組織中miR-21的相對表達量為（4.222±1.755），正常腦組織中miR-21的相對表達量為（1.064±0.126），差異有統計學意義（P < 0.05）。對215例膠質瘤組織中miR-21和PTEN的表達情況進行相關性分析，結果顯示膠質瘤組織中miR-21與PTEN的表達呈負相關（r=-0.448，P < 0.05）。miR-21在膠質瘤組織中的表達升高，可能通過負性調節PTEN的表達，在膠質瘤的發生發展中發揮作用。二者的表達可以顯示膠質瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質瘤中的表達有助于評價膠質瘤的惡性程度和生物學行為。

綜上所述，本研究為PTEN作為miR-21的靶基因提供了新的依據，miR-21和PTEN的表達水平可以膠質瘤的惡性程度，通過檢測二者在膠質瘤中的表達有助于評價膠質瘤的惡性程度和生物學行為。

[參考文獻]

[1]Chen CZ，Li L，Lodish HF，et al. MicroRNAs modulate hema topoietic lineage differentiation [J]. Science，2004，303（5654）：83-86．

[2]Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（9）：2999-3004.

[3]Yao Q，Xu H，Zhang QQ. MicroRNA-21 promotes cell proliferationand down-regulates the expression of programmed cell death 4（PDCD4）in HeLacervical carcinoma cells [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，388（3）：539-542.

[4]Wickramasinghe NS，Manavalan TT，Dougherty SM，et al. Estradiol down regulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression inMCF-7 breast cancer cells [J]. Nucleic Acids Research， 2009， 37（8）：2584–2595.

[5]Papagiannakopoulos T，Shapiro A，Kosik KS. MicroRNA-21 targets a network of key tumor-suppressive pathways in glioblastoma cells [J]. Cancer Res， 2008，68（19）：8164-8672.

[6]Ciafre SA，Galardi S，Mangiola A，et al. Extensive modulation of a set of micro RNAs in primary glioblastoma [J]. Biochem Biophys Res Commun，2005，334（4）：1351.

[7]Cheng AM，Byrom MW，Shelton J，et al. Antisense inhibition of human miRNAs andindications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis [J]. Nucleic Acids Res，2005，33（4）：1290-1297.

[8]Chu EC，Tarnawski AS. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology [J]. Med Sci Monit，2004，10（10）：235-241.

[9]Fisher JL，Schwartzbaurn JA，Wrenseh M，et al. Epidemiology of brain tumors [J]. Neurol Clin，2007，25（4）：867-890.

[10]Lu Z，Liu M，Stribinskis V，et al. MicroRNA-21 Promotes cell transformation by targeting the Programed cell death 4 gene [J]. Oncogene，2008，27（31）：4373-4379.

[11]Slaby O，Svoboda M，Fabian P.Altered expression of miR-21，miR-31，miR-143 and miR-145 is related to clinicopathologic features of colorectal cancer [J]. Oncology，2007，72（5-6）：397-402.

[12]Huang GL，Zhang XH，Guo GL，et al. Clinical significance of miR-21 expressionin breast cancer：SYBR-Green I-based real-time RT-PCR study of invasive ductalcarcinoma [J]. Oncol Rep，2009，21（3）：673-679.

[13]Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR，et al. Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21 [J]. Cancer Cell，2010，18（3）：282-293.

（收稿日期：2013-11-30本文編輯：任念）

[基金項目] 上海市科學技術委員會科研計劃項目（編號12 ZR1423400）。

[通訊作者] 陳先震（1976-），男，副主任醫師，副教授，碩士生導師；研究方向：顯微神經外科微創治療各種顱內腫瘤、腦血管病、脊髓腫瘤。