土荊芥花序和葉揮發油的抑菌作用及組分分析

陳利軍， 智亞楠， 王國君， 史洪中

(信陽農林學院農業科學系, 信陽 464000)

土荊芥花序和葉揮發油的抑菌作用及組分分析

陳利軍*， 智亞楠， 王國君， 史洪中

(信陽農林學院農業科學系, 信陽 464000)

采用水蒸氣蒸餾法分別提取采自河南信陽的土荊芥花序和葉的揮發油，采用GC-MS進行組分分析，并測定揮發油的抑菌作用。結果表明：土荊芥花序和葉的揮發油的含油率分別為4.02%和1.64%；GC-MS從揮發油中分別分離到10個和9個組分，均鑒定出7個組分，占揮發油總量的98.431%和99.103%；揮發油的主要組分均為驅蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，但相對含量差異較大；葉和花序的揮發油對小麥赤霉病菌具有強烈的熏蒸抑制作用，EC50分別為1.46 μL/皿和1.80 μL/皿。

土荊芥; 揮發油; GC-MS分析; 抑菌作用; 不同部位

土荊芥(ChenopodiumambrosioidesL.)為藜科一年生或多年生草本植物[1]，含豐富的揮發油。多項研究顯示土荊芥揮發油具殺蟲[2-5]、抑菌[6-9]、殺線蟲[10]、抗氧化[6]等生物活性，揮發油易揮發的特性使土荊芥揮發油有望作為倉儲、設施農業、土壤等的熏蒸劑防控病、蟲、線蟲等的為害。原產于熱帶美洲的土荊芥，現廣泛分布于世界熱帶及溫帶地區[1]，在河南信陽也是常見的雜草，不同產地土荊芥揮發油化學組分和活性差異較大[5,7-9,11]，同一種植物的不同部位揮發油的含量、組分也不同[12]。已研究證明從產自河南信陽的新鮮土荊芥提取的揮發油對植物病原真菌具有極強的熏蒸抑制作用[13]。為了進一步掌握河南信陽土荊芥不同部位揮發油的含量、組分及抑菌活性，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取土荊芥花序和葉片的揮發油，測定干品的含油率，采用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)分析揮發油的化學組分，并以小麥赤霉病菌為目標菌，測定了揮發油的抑菌活性，以期為土荊芥在農業上的開發應用提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

土荊芥花序和葉：供試土荊芥全草于2012年8月下旬采自信陽市震雷山，室內分花序和葉，自然風干(10～12 d)后，剪為不超過0.5 cm的小段。

植物病原真菌菌株：小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，由信陽農林學院植物病理實驗室分離保存。

培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，水1 000 mL)。

主要儀器與設備：Agilent 6850/5975氣質聯用儀(GC-MS)，NIST05譜庫。

1.2 土荊芥花序和葉揮發油的提取

精確稱量樣品，采用水蒸氣蒸餾法，連續提取2 h，得淺黃色具濃郁氣味的油狀液體，即揮發油，計算含油率，重復3次。揮發油4 ℃冰箱保存備用。含油率(V/W)的計算公式如下：

含油率(%)=揮發油體積×100/樣品重量。

1.3 揮發油熏蒸抑菌作用測定

對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸抑制作用測定采用生長速率法：在直徑90 mm的培養皿中加入15 mL融化的PDA培養基(約60 ℃)，搖勻制成厚薄均勻平板，平板中央接種一塊直徑為5 mm的植物病原真菌菌餅。然后在皿蓋上放置一滅菌的直徑11 mm圓形濾紙片，吸取一定劑量的揮發油滴加到濾紙片上。皿底皿蓋對扣，parafilm封口膜密封，25 ℃培養，72 h后觀察植物病原真菌的生長情況，并采用十字交叉法測量病原真菌菌落直徑，計算抑菌率。揮發油的劑量設7個處理，分別為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0 μL，以僅放一濾紙片不滴加揮發油為對照，重復3次。

抑菌率(%)=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)×100/對照菌落生長直徑；

根據生物統計概率換算表，將抑菌率換算成概率值，以概率值(Y)為縱坐標、揮發油劑量的對數值(X)為橫坐標建立毒力回歸方程，利用方程求得概率值為5和6.2816時的劑量即為EC50和EC90值。

1.4 揮發油GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，程序升溫，柱初溫60 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升溫速率升至90 ℃，再以10 ℃/min升溫速率升至180 ℃，載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min，進樣量1.0 μL。質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

2 結果與分析

2.1 土荊芥花序和葉揮發油的含油率

采用水蒸氣蒸餾法提取土荊芥花序和葉的揮發油，含油率分別為4.02%和1.64%。

2.2 土荊芥花序和葉揮發油組分GC-MS分析

分別對土荊芥花序和葉的揮發油組分進行GC-MS分析，總離子流圖見圖1。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，所得質譜圖經NIST05質譜數據庫檢索，并與標準圖譜核對,分別從土荊芥花序和葉的揮發油中分離出10個和9個組分(表1)，其中花序揮發油中鑒定出了7個組分，占總成分的98.431%，葉揮發油中鑒定出了7個組分，占總成分的99.103%。從表1可以看出土荊芥花序和葉的揮發油組分基本相同，但相對含量差異較大。兩者揮發油主要組分均為驅蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，其中相對含量最高的組分均為驅蛔素，相對含量分別為40.284%和34.425%。

表1土荊芥花序和葉的揮發油化學成分1)

Table1ThechemicalconstituentsoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioides

峰號No．保留時間/mintR化合物Compounds分子式Formula相對含量/%Relativecontent花序Flower葉Leaf15．531α?松油烯α?TerpineneC10H1615．81723．38625．610p?傘花烴p?CymeneC10H147．7004．714313．335未鑒定Unknown0．6780．375414．1352?蒈烯2?CareneC10H1628．16023．567514．898未鑒定Unknown0．4850．522615．446未鑒定Unknown0．406-717．737驅蛔素AscaridoleC10H16O240．28434．425818．0263?甲基?4?異丙基酚3?Methyl?4?isopropylphenolC10H14O2．9735．375918．328麝香草酚ThymolC10H14O2．9245．3671028．135鄰苯二甲酸異丁基辛酯Phthalicacid，isobutyloctylesterC20H30O40．5752．269

1) -：無 -: n/a

圖1 土荊芥花序和葉揮發油的GC-MS總離子流圖

2.3 對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用

以生長速率法在90 mm培養皿中測定土荊芥花序和葉的揮發油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用，結果見圖2、表2。從表2可看出，土荊芥花序和葉的揮發油對供試菌種菌絲生長都有一定的熏蒸抑制作用，抑制作用隨劑量增加而增強。在相同劑量條件下，葉的揮發油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制活性比花序揮發油的活性高。2.5 μL/皿的劑量，葉揮發油的抑制率達到78.64%，花序揮發油的抑制率達到64.55%。5 μL/皿和10 μL/皿的劑量對小麥赤霉病菌的抑制率均達到100%。

圖2 土荊芥花序和葉揮發油對小麥赤霉病菌的熏蒸抑制作用

表2土荊芥花序和葉揮發油對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸抑制作用

Table2FumigationantifungalactivityofessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction抑制率/%Inhibitoryratio0．5μL/皿1．0μL/皿1．5μL/皿2．0μL/皿2．5μL/皿5．0μL/皿10μL/皿花序Flower4．5528．1839．0955．4564．55100．00100．00葉Leaf5．4535．0051．3663．1878．64100．00100．00

表3為72 h后土荊芥花序和葉的揮發油對小麥赤霉病菌菌絲生長的熏蒸作用毒力測定結果，根據毒力回歸方程計算EC50和EC90。結果表明，揮發油對小麥赤霉病菌的毒力回歸方程具有很好的相關性，表現出明顯的正相關，即隨著濃度不斷增加,揮發油對供試病原菌抑制活性逐漸增強。土荊芥花序和葉的揮發油均有強烈的抑菌作用。葉的揮發油活性較高，EC50僅為1.46 μL/皿，EC90為3.59 μL/皿；花序揮發油的EC50為1.80 μL/皿，EC90為4.98 μL/皿。

表3土荊芥花序和葉揮發油對小麥赤霉病菌菌絲生長的毒力測定結果

Table3ToxicityoftheessentialoilsfromflowersandleavesofC.ambrosioidestomycelialgrowthofF.graminearum

提取部位Extraction毒力回歸方程(Y=)Regressionequationofantifungalactivity相關系數CorrelativecoefficientEC50/μL·皿-1EC90/μL·皿-1花序Flower2．8990X+4．26030．98601．804．98葉Leaf3．2828X+4．45840．98721．463．59

3 結論與討論

采自河南信陽的土荊芥花序含油率為4.02%，遠高于葉的含油率1.64%，也高于果實的含油率2.48%(數據另文發表)。而土荊芥莖的含油率極低，因此未被列入本研究對象。

GC-MS從土荊芥花序和葉揮發油中分別分離到10個和9個組分，其中均有7個組分被鑒定，分別占其揮發油總量的98.431%和99.103%。土荊芥花序和葉揮發油的組分基本相同，但相對含量差異較大。花序揮發油的主要成分為驅蛔素、2-蒈烯和α-松油烯，相對含量分別為40.284%、28.160%和15.817%；而葉揮發油的主要成分及相對含量高低順序與花序相同，其相對含量分別為34.425%，23.567%和23.386%，即α-松油烯的相對含量高于花序，驅蛔素和2-蒈烯的相對含量低于花序。驅蛔素、2-蒈烯和α-松油烯也在多地土荊芥的揮發油中檢測到，或是相對含量較高的成分[5,14]。

土荊芥花序和葉的揮發油對小麥赤霉病菌均有強烈的熏蒸抑制作用，且葉的揮發油活性較高，EC50為1.46 μL/皿。前人對土荊芥揮發油抑菌活性測定多采用平板給藥[6-7]，如Jardim等測定了采自巴西的土荊芥揮發油對8種采后真菌(Aspergillusspp.，Colletotrichumspp.，Fusariumspp.等)的抑制活性，結果顯示，PDA培養基揮發油濃度為0.3%時，完全抑制所有真菌的生長，濃度為0.1%時，抑制率在90%～100%間[7]。因揮發油的易揮發性，更有利于通過熏蒸作用起到生物抑制活性，所以本研究測定的是土荊芥花序和葉揮發油的熏蒸抑菌作用。

多項研究證實土荊芥揮發油具有抑制真菌活性[6-7,9-13]，作用于真菌后，菌絲體結構被破壞、原生質體凝集、蛋白質缺失或增加[9]，驅蛔素是主要的抑菌化合物[7]。p-傘花烴、麝香草酚等化合物也具有抑制真菌活性[7-15]。本研究土荊芥花序和葉揮發油組分含量最高的化合物均為驅蛔素，p-傘花烴和麝香草酚的相對含量之和均大于10%。土荊芥花序和葉的揮發油的強烈的熏蒸抑菌作用可能源于其含有多種抑菌物質，且相對含量很高。土荊芥花序和葉的揮發油抑菌機制及單體組分在抑制真菌活性中的作用有待進一步研究。

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TheantifungalactivityandchemicalconstituentanalysisofessentialoilsfromflowersandleavesofChenopodiumambrosioides

Chen Lijun, Zhi Yanan, Wang Guojun, Shi Hongzhong

(DepartmentofAgriculturalSciences,XinyangCollegeofAgricultureandForestry,Xinyang464000,China)

Essential oils from the flowers and leaves ofChenopodiumambrosioidesL. in Xinyang City of Henan Province were extracted by steam distillation, and their chemical constituents were analyzed by GC-MS. The antifungal activity of essential oils was also studied. The results showed that the yields of essential oils from the flowers and leaves were 4.02% and 1.64%, respectively. Ten and 9 constituents were isolated, and 7 constituents were identified, accounting for 98.431% and 99.103% of the total essential oils from the flowers and leaves by GC-MS, respectively. The main chemical constituents of all essential oils were ascaridole, 2-carene and α-terpinene, but the relative contents varied. The essential oils from leaves and flowers showed strong fumigation antifungal activity toFusariumgraminearum, with an EC50value of 1.46 μL/dish and 1.80 μL/dish, respectively.

Chenopodiumambrosioides; essential oil; GC-MS analysis; antifungal activity; different parts

2013-11-18

：2013-12-28

河南省科技攻關項目(122102310257)；信陽市科技攻關項目(130016)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.007

* 通信作者 E-mail: chlijun1980@163.com