寒區昆蟲病原線蟲冷凍儲存條件優化

李春杰， 譚國忠， 王 義， 許艷麗*

(1.中國科學院東北地理與農業生態研究所,黑土區農業生態院重點實驗室， 哈爾濱 150081;2. 美國Rutgers大學， 新澤西 08901)

寒區昆蟲病原線蟲冷凍儲存條件優化

李春杰1， 譚國忠1， 王 義2， 許艷麗1*

(1.中國科學院東北地理與農業生態研究所,黑土區農業生態院重點實驗室， 哈爾濱 150081;2. 美國Rutgers大學， 新澤西 08901)

以我國高寒地區分離、篩選出的高致病力昆蟲病原線蟲嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora-HBN)為研究對象，對其冷凍儲存條件進行優化。結果顯示，介質中不同含水量對線蟲HBN的冷凍存活率有著顯著的影響；其中含水量為50%的蛭石中線蟲回收率最高，為87.4%；冷凍儲存后的線蟲經4 ℃ 24 h+室溫1 h解凍利于線蟲冷凍休眠后復蘇；線蟲經階段性降溫較直接降溫至-4 ℃的冷凍存活率提高31.6百分點；儲存介質蛭石中采用滅菌自來水較適于HBN線蟲在-4 ℃冷凍存活；7 d內冷凍儲存增強了HBN線蟲對寄主昆蟲的侵入能力。

昆蟲病原線蟲; 冷凍儲存; 存活率; 侵入力

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematode，EPN)是指體內攜帶具有病原性的共生細菌能引起寄主昆蟲致病的一類寄生性線蟲，是昆蟲的重要天敵類群，對200多種昆蟲有致病作用[1]，這種新型生物殺蟲劑具有廣闊的應用前景。但該線蟲常溫儲存貨架期短，是其推廣應用的主要障礙因素之一。該線蟲在低溫下處于靜止休眠狀態，新陳代謝速度減慢、體能消耗減少，從而可延長線蟲貨架期。所以，當今學者們對低溫儲存尤為感興趣，但適于低溫儲存的材料和儲存技術尚未解決。

李春杰等[2]根據寒區昆蟲病原線蟲在黑龍江省越冬的自然環境條件調查結果，對其室內低溫儲存條件進行了初步篩選，但如何提高線蟲冷凍后的存活率仍需進一步研究。儲存介質種類和濕度、解凍方法、降溫速度和介質中的溶液均影響著冷凍儲存后線蟲的存活和線蟲對寄主的侵染能力。不同種線蟲對降溫速度表現出明顯的差異，蕪菁夜蛾斯氏線蟲(Steinernemafeltiae)經過直接降溫后，低溫存活率顯著提高；而嗜菌異小桿線蟲(Heterorhabditisbacteriophora)經過階段性降溫馴化后，其低溫存活率較直接降溫后的存活率明顯增加[3]。Grewal等[4]的研究表明，階段性降溫使斯氏線蟲S.carpocapsae和S.riobrave所獲得的耐寒性好于直接降溫。適宜的滲透壓可使線蟲慢速脫水，有利于線蟲的儲存[5-6]。楊秀芬等[7]的試驗證實了低溫誘導有助于培育斯氏線蟲適應0 ℃以上的低溫特性，但返回25 ℃培養2個侵染循環后這種特性有不同程度的喪失。

很多研究者通過多種方法可提高昆蟲病原線蟲在0 ℃以上暫時的耐寒性，而作者以我國高寒地區分離、篩選的高致病力線蟲為研究對象，該線蟲對寒冷地區生態適應能力強。根據該線蟲能在黑龍江省越冬的自然現象及其低溫儲存潛力挖掘[2,8]，其耐寒性和室內儲存溫度、介質的種類和線蟲的儲存濃度等已得到初步探索[9-11]，通過進一步對線蟲冷凍儲存條件進行優化，試圖提高冷凍后的存活率，以挖掘冷凍儲存潛力，為改善昆蟲病原線蟲儲存技術提供依據，從而加快我國寒區高致病力線蟲的開發應用速度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試線蟲

從黑龍江省哈爾濱市松樹下土壤中分離得到的高致病力的昆蟲病原線蟲，由加拿大線蟲博物館鑒定，為嗜菌異小桿線蟲哈爾濱品系[H.bacteriophora-HBN(HBN)]。供試寄主昆蟲為大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲,從天津中墾進出口公司購買。

1.1.2 試驗儀器和器皿

DHP-9162 a恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、BCD-226 sTV控溫冰箱(青島海爾股份有限公司)、S633069冷光源解剖鏡(麥克奧迪實業集團有限公司)、LDZX-40 sCI高壓滅菌器(上海市申安醫療器械廠)、200 mL玻璃瓶、直徑60 mm的塑料培養皿、直徑90 mm的玻璃培養皿和12孔細胞培養板。

1.2 試驗方法

1.2.1 儲存介質對線蟲的冷凍存活及回收率的影響

選擇蛭石、海綿、沙土(沙和土質量比為1∶1)和珍珠巖4種介質。試驗所用的昆蟲病原線蟲HBN采用White-Trap繁殖法[12-13]，新繁殖出來的線蟲于10 ℃保存7 d備用。稱取不同介質各10 g裝在200 mL玻璃瓶內，根據目前該實驗室對不同儲存介質含水量初篩結果[8]，每種介質設4個不同含水量(按介質和水的質量比)，蛭石含水量設40%、50%、60%、70%，海綿含水量設20%、30%、40%、50%，沙土含水量設8%、10%、12%、14%，珍珠巖水量設80%、90%、100%、110%，共16個處理，每個處理6瓶，每瓶分別加入105條HBN侵染期線蟲。將所有處理直接于-4 ℃儲存5 d，然后拿出玻璃瓶于室溫1 h后收集介質中線蟲。介質為蛭石、海綿和珍珠巖的用80目和500目套篩過濾，收集500目上的線蟲懸浮液，懸液再用蔗糖梯度離心法[14]，收集各處理中的線蟲，沙土中的線蟲直接用蔗糖梯度離心法收集。每種介質中選擇線蟲存活率最高的1個含水量，計算回收到的線蟲占起初存放介質中線蟲量的比例，即回收率。在解剖鏡下調查收集到線蟲的存活率。

1.2.2 解凍方法對線蟲冷凍存活的影響

向含水量為50%的10 g蛭石中加入105條HBN侵染期線蟲，共18瓶。-4 ℃直接冷凍5 d，然后按不同方法解凍，(1)室溫解凍24 h：把冷凍后的樣品直接放在室溫下解凍24 h；(2)水中直接解凍：室溫下直接加水、浸泡1 h解凍；(3)4 ℃解凍24 h：把冷凍后的樣品放在4 ℃冰箱中解凍24 h，然后再置于室溫1 h。6瓶為一個處理，分別采用不同方法解凍，收集解凍后樣品中的線蟲，顯微鏡下記錄線蟲的存活情況，計算冷凍后經不同方法解凍后線蟲的存活率。

1.2.3 降溫方式對介質中線蟲冷凍存活的影響

稱取蛭石、沙土(1∶1)、海綿和珍珠巖各10 g裝在玻璃瓶內，每種中介質線蟲儲存濃度均為104條/g，選擇4種介質中線蟲存活率最高的含水量分別為12%、50%、30%和100%。每個處理12瓶，共48瓶，平均分成兩組，一組降溫方式為直接降溫法，即直接于-4 ℃儲存5 d，另一組為階段式降溫，以1 ℃/10 min速度降溫，于-1 ℃存放1 h，然后再以1 ℃/10 min速度降溫至-4 ℃儲存5 d[10-11]。然后升溫至4 ℃保持24 h，于室溫放置1 h后調查其存活率。

1.2.4 介質中溶液對線蟲冷凍存活的影響

介質中溶液設置滅菌蒸餾水(SDW)、非滅菌自來水(ATW)、滅菌自來水(SATW)、0.1 mol/L的NaCl和M9 Buffer 5種不同溶液進行-4 ℃儲存5 d，降溫方式采用階段式降溫法，解凍方法采用4 ℃解凍24 h再室溫1 h的方式，顯微鏡下記錄線蟲的存活情況，計算不同溶液中冷凍后線蟲的存活率。

M9 Buffer：Na2HPO46 g， KH2PO43 g， NaCl 5 g， MgSO40.128 g， DDW 1 L，121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2.5 冷凍對線蟲侵入寄主能力的影響

將大蠟螟末齡幼蟲放入12孔細胞培養板中，每孔一頭幼蟲，孔內墊有2層濕潤濾紙。將冷凍3、5和7 d后收集的活線蟲與大蠟螟幼蟲按5∶1接種，以未經冷凍處理的線蟲HBN作為對照，共5個處理，每個處理3個板。接種后于25 ℃恒溫培養箱中，48 h從細胞培養板中取出死亡大蠟螟幼蟲，用清水沖洗。置于25 ℃培養箱中，48 h后解剖死亡大蠟螟幼蟲，解剖鏡下檢查大蠟螟幼蟲體內的雌蟲數量，雌蟲是由侵入大蠟螟幼蟲體內的侵染期線蟲發育而成，從而可計算出線蟲的侵入率。

侵入率(%)=侵入大蠟螟體內的雌蟲數/侵染每頭大蠟螟所用的線蟲數×100。

1.3 數據統計與分析

所有試驗重復3次，調查的原始數據經Excel處理和SPSS 11.5軟件分析，計算所得百分數經反正弦平方根轉換，然后采用單因素0.05水平方差分析(One-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 儲存介質對線蟲的冷凍存活及回收率的影響

2.1.1 介質含水量對線蟲冷凍存活率的影響

不同種儲存介質中的線蟲冷凍后存活率存在差異，其中珍珠巖中的最高存活率顯著低于其他3種介質中的最高存活率。不同含水量介質對HBN線蟲低溫儲存后的存活率也有著明顯影響。含水量為50%的蛭石中線蟲存活率最高，為47.6%，含水量為70%的蛭石中線蟲存活率最低，為27.9%(圖1a)；含水量30%的海綿中線蟲存活率最高，為41.5%，含水量50%時線蟲存活率最低，為15.6%(圖1b)；含水量12%的沙土中線蟲存活率最高，為50.3%，含水量14%時線蟲存活率最低，為20.9%(圖1c)；含水量100%的珍珠巖中線蟲存活率最高，為34.3%，含水量80%時線蟲存活率最低，為13.7%(圖1d)。可見4種介質中線蟲最高存活率和最低存活率之間差異均顯著(P<0.05)，并且除珍珠巖外其他3種介質中含水量最高的線蟲存活率最低。

圖1 介質含水量對線蟲冷凍存活率的影響

2.1.2 儲存介質對線蟲回收率的影響

選擇4種介質中存活率最高的一種含水量，計算介質中HBN線蟲的回收率，結果顯示(圖2)，含水量50%蛭石中的線蟲回收率最高，為87.4%，其次是含水量12%的沙土為75%，含水量100%珍珠巖為58.3%，含水量30%的海綿為14.7%。只有回收率高才有利于線蟲的高效應用，即應用時從介質中釋放線蟲效率高。因為含水量為50%蛭石中的線蟲存活率和回收率均最高，所以含水量為50%的蛭石較適合HBN的-4 ℃冷凍儲存。可能是由于不同介質的結構不同使線蟲向外游離時所受阻力不同，導致線蟲游離速度不同。

圖2 不同儲存介質對H. bacteriophora-HBN回收率的影響

2.2 解凍方法對線蟲存活的影響

含水量為50%蛭石中的HBN線蟲于-4 ℃直接冷凍5 d后，分別經過不同方法解凍。其中，4 ℃解凍24 h后再置于室溫1 h后線蟲存活率最高，為59.8%(圖3)，于室溫解凍24 h后線蟲存活率次之，為45.5%，水中直接解凍線蟲存活率最低，為37.4%。試驗表明線蟲在冷凍后需要一定的解凍條件，才能恢復其活性，但不同的解凍條件對線蟲復蘇后的存活率有一定影響。可以看出3種解凍方式中，4 ℃24 h的解凍方式有利于線蟲HBN的冷凍存活，直接于室溫解凍和水中直接解凍線蟲存活率較低。

2.3 降溫方式對介質中線蟲冷凍存活的影響

2.3.1 最佳含水量的不同介質對線蟲冷凍存活的影響

兩組線蟲于-4 ℃冷凍5 d后，回收4種介質中的線蟲HBN，顯微鏡下線蟲存活率調查結果顯示(圖4)，不同儲存介質對HBN冷凍存活的影響很明顯。經過階段性降溫后再-4 ℃儲存的一組，含水量為50%的蛭石中HBN存活率最高，為79.2%，其次含水量30%的海綿中HBN存活率為77.2%，含水量12%的沙土為70.1%，含水量100%珍珠巖為35.6%。復蘇后鏡下觀察蛭石和海綿中的線蟲活動較沙土和珍珠巖中的線蟲活躍很多，分析原因可能是沙土和珍珠巖中儲存的線蟲因缺氧而窒息，尤其是珍珠巖中的線蟲活動能力很差。可以看出含水量50%的蛭石中和含水量30%的海綿宜于HBN的冷凍儲存。

圖3 解凍方式對HBN線蟲存活率的影響

圖4 介質和降溫方式對H. bacteriophora-HBN 冷凍存活率的影響

2.3.2 降溫速度對線蟲冷凍存活的影響

降溫速度對線蟲HBN在-4 ℃下儲存5 d的冷凍存活有著明顯的影響(圖4)。除了含水量100%珍珠巖外，采用階段性降溫法的3種儲存介質中的線蟲冷凍存活率顯著高于直接降溫法(P<0.05)。含水量為50%的蛭石中HBN較直接降溫的存活率高出31.6百分點，在含水量為30%的海綿中較直接降溫的存活率高出35.7百分點，在含水量為12%的沙土中較直接降溫的存活率高出19.8百分點，在含水量為100%珍珠巖中HBN較直接降溫的存活率僅高出1.3百分點。可以看出采用逐步緩慢降溫法有利于含水量為50%的蛭石、30%的海綿和12%的沙土中HBN線蟲體內脫水休眠，提高其冷凍存活率。

2.4 介質中溶液對線蟲冷凍存活的影響

含50%滅菌自來水的蛭石中線蟲HBN存活率最高，為79.2%，顯著高于未滅菌自來水(圖5)，但與M9 Buffer、0.1 mol/L NaCl和滅菌蒸餾水差異不顯著。

圖5 不同液體滲透壓對H. bacteriophora-HBN冷凍存活的影響

2.5 冷凍儲存后對線蟲侵入寄主能力的影響

冷凍后HBN線蟲侵入大蠟螟體內的比例較未冷凍的明顯增加(圖6)。-4 ℃冷凍3、5和7 d后線蟲侵入率均達40%以上，差異不顯著，但均顯著高于未冷凍(CK)的侵入率(P<0.05)，并較未冷凍的侵入率高出10百分點以上。

圖6 冷凍后HBN線蟲對大蠟螟的侵入率

3 討論

從昆蟲病原線蟲分布來看，嗜菌異小桿線蟲在加拿大、丹麥、愛爾蘭和俄羅斯等地均有分布[1]，可以看出昆蟲病原線蟲能夠忍受0 ℃以下的低溫，并在這些寒冷地區長期生存。而在中國曾在廣東、山東和河北分離到嗜菌異小桿線蟲[15-16]，筆者雖然在黑龍江省已經分離到了嗜菌異小桿線蟲[2]，但對其耐寒性的利用值得探討。該研究表明寒區昆蟲病原線蟲HBN于-4 ℃的最佳儲存介質為含水量50%的蛭石，該介質利于線蟲的冷凍存活和應用時的釋放；采用階段性降溫和冷凍后采用4 ℃ 24 h再置于室溫的解凍方法，冷凍過程中介質中的溶液采用滅菌自來水，這些條件較適合線蟲在低溫下脫水和解凍時復原，更利于線蟲HBN的冷凍存活，并且-4 ℃下冷凍儲存7 d內線蟲對寄主昆蟲的侵染活性增強。該研究結果將為寒區昆蟲病原線蟲實行低溫儲存提供可靠依據，為該線蟲的研發及今后當地害蟲防治打下良好基礎。

線蟲的脫水能力在其冷凍存活過程中起著重要的作用，低濕休眠狀態極利于無脊椎動物的冷凍存活[17]。低濕休眠利于線蟲的長期儲存，可提高Steinernemacarpocapsae的存活率，延長壽命3個月，也提高了它對不利環境的適應性[3]。儲存介質及介質含水量對線蟲的脫水速度有著很大的影響。因為介質中含水量大，不利于線蟲冷凍過程中體內向外脫水進入休眠，線蟲體內較大的含水量使線蟲體內迅速結冰，細胞體積膨大至破裂，最終導致線蟲死亡。由于不同介質的結構不同使其蓄水能力和含氧量不同，影響了線蟲的冷凍存活。提高病原線蟲存活率有多種方法，通過利用甘油和離子溶液混合可增強線蟲S.carpocapsae‘All’的耐寒性[5]。Chen和Glazer[18]通過逐漸增加溶液滲透壓提高線蟲的存活率。該研究中0.1 mol/L的NaCl中的HBN于-4 ℃冷凍5 d的存活率稍高于人工自來水中的HBN，但又稍低于滅菌人工自來水。可能是M9 Buffer和0.1 mol/L NaCl中的離子濃度偏高，使得線蟲體內脫水過多而干死，滅菌蒸餾水中離子濃度太低，不利于線蟲體內的冷凍脫水，使得線蟲冷凍過程中體內結冰致死。

Wharton等[19]認為線蟲的低溫存活率與冷卻速率有關。在快速結冰環境中，部分線蟲由于不斷增長的冰晶而受到機械損傷，造成體內物質從皮層傷口處流出，而較慢的冷卻速率可以抑制接種性結冰，有助于線蟲低溫存活。同時，緩慢降溫使線蟲產生保護性脫水，進行低濕休眠。試驗中階段性降溫利于線蟲體內脫水進入低濕休眠，也證實了以前學者的觀點。同樣，線蟲的冷凍存活率也受到解凍速度的影響。由于線蟲在經歷低溫后進入休眠狀態，低溫過程中線蟲脫去體內多余的水，以防止發生結冰造成傷害，而迅速升溫后線蟲吸水，細胞急劇膨脹，破壞了細胞膜的彈性，最終細胞膜破裂導致線蟲死亡，存活率降低。所以緩慢升溫利于細胞的復原。

通過蒸發脅迫[20]和高滲脫水[21]，侵染期小卷蛾斯氏線蟲(S.carpocapsae)安全脫水休眠，加水后脫水休眠的線蟲在1 h 內復蘇后侵染力沒有受到不良影響。Brown等[22]報道了S.riobravis、S.carpocapsae和S.glaseri3種線蟲經低溫處理后，線蟲的侵染力沒有顯著變化。通常情況下，昆蟲病原線蟲無論接種量多少，由于線蟲間的相互競爭，只有一部分個體表現出較強的侵染能力，而其他的線蟲處于非活躍狀態。該試驗中0 ℃以下的低溫儲存過程中線蟲消耗了體能，解凍后線蟲處于饑渴狀態，侵入寄主取食的欲望更加強烈，所以短期冷凍儲存增強了HBN線蟲的侵染活性。

本研究利用耐寒性很強的寒區昆蟲病原線蟲，對其冷凍儲存條件的進一步篩選，得到了適宜的儲存介質、介質中的溶液和降溫方式，但是關于該昆蟲病原線蟲的耐寒機制還不清楚，如受低溫脅迫線蟲體內產生的一系列生理生化反應，包括脅迫脫水、改變代謝酶活性、飽和脂肪酸轉換為非飽和脂肪酸、累積海藻糖以及合成新同工酶等[23]。受低溫脅迫時還涉及一系列相關基因的激活與沉默，最終體現為線蟲對環境脅迫的耐受能力，這是一個錯綜復雜的網絡式調控體系，需要逐步探索。

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OptimizingfreezingstorageconditionsfortheentomopathogenicnematodeisolatedfromthecoldregioninChina

Li Chunjie1, Tan Guozhong1, Wang Yi2, Xu Yanli1

(1.KeyLaboratoryofMollisolsAgroecology,NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin150081,China; 2.RutgersUniversity,NewJersey08901,USA)

One high-virulence strain of EPNs,Heterorhabditisbacteriophora-HBN (HBN) with cold tolerance isolated from Harbin City was used in the laboratory in this study. Storage substance species and moisture, cooling rate, thawing ways and osmotic pressure of solution in the substances were optimized. The results showed that freezing survival of HBN were significantly affected by the substances with different water contents. Recycling coefficient ofH.bacteriophora-HBN in the vermiculite with water content of 50% was the highest (87.4%). The way of freezing HBN at room temperature for 1h following 4 ℃ for 24h was in favor of thawing of freezing dormancy. Freezing survival rate of HBN by phasic cooling pattern was increased by 31.6 percent than by direct cooling to -4 ℃. Sterilized artificial tap water in vermiculite was conducive to anhydrobiosis of HBN. The ability of HBN infectingGalleriamellonellawas enhanced in the short-term freezing storage in seven days.

entomopathogenic nematode; freezing storage; survival rate; infective ability

2013-10-15

：2014-01-25

國家科技計劃農業成果轉化項目(2007GB24910482)；中國科學院知識創新工程重要方向項目(KSCX2-YW-N-092)；黑龍江省青年科學基金項目(QC2010070)；哈爾濱市科技創新人才項目(2009RFQYN092)

S 476.15

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.009

致謝：感謝加拿大線蟲博物館郁慶館長在線蟲鑒定工作方面給予的幫助。

* 通信作者 E-mail: xyll@neigaehrb.ac.cn