油菜田看麥娘對精喹禾靈的抗性水平及抗性機理研究

?，|瑋， 劉藝嫵， 劉祥英， 羅 坤， 柏連陽,2*

(1. 湖南農業(yè)大學農藥研究所， 長沙 410128; 2. 湖南省農業(yè)科學院， 長沙 410128)

油菜田看麥娘對精喹禾靈的抗性水平及抗性機理研究

?，|瑋1， 劉藝嫵1， 劉祥英1， 羅 坤1， 柏連陽1,2*

(1. 湖南農業(yè)大學農藥研究所， 長沙 410128; 2. 湖南省農業(yè)科學院， 長沙 410128)

采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測定了湖南省境內長沙市、永州市、常德市、益陽市、瀏陽市、岳陽市、婁底市7個市州10個地區(qū)油菜田看麥娘潛在抗藥性種群對精喹禾靈的抗性水平，測定了常德市桃源地區(qū)看麥娘潛在抗藥性種群以及敏感種群谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)對精喹禾靈的敏感性，對桃源地區(qū)看麥娘抗性品系及敏感品系ACCase基因片段進行擴增和測序，比較了兩種生物型的基因序列。培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法測定結果表明：常德市桃源地區(qū)看麥娘抗藥性生物型對精喹禾靈的抗性水平最高，抗性倍數(shù)為10.50倍，其他地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)在2.01～7.09倍之間，抗性水平不明顯；盆栽法測定結果表明：桃源地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)最高，為25.30倍，其他地區(qū)看麥娘抗性倍數(shù)在2.43～9.47倍之間，尚未產(chǎn)生明顯抗藥性。經(jīng)精喹禾靈處理后，看麥娘抗藥性生物型的GSTs活力在第5天明顯高于敏感生物型，表明GSTs的活性是引起看麥娘對精喹禾靈抗性的重要因子。通過靶標基因片段擴增與DNA測序比對發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型氨基酸序列第93位比敏感生物型多出一個丙氨酸，抗藥性的產(chǎn)生與靶標基因的突變是否相關需要進行進一步驗證。

油菜田； 看麥娘； 精喹禾靈； 抗藥性

看麥娘(AlopecurusaequalisSobol.)為我國常見田間惡性雜草，屬禾本科(Poaceae)禾亞科(Agrostidoideae)看麥娘屬(Alopecurus)，多危害小麥、油菜等夏收作物[1-2]。目前用于防治油菜田看麥娘的莖葉處理劑以乙酰輔酶A羧化酶ACCase抑制劑類為主，其主要包括兩大類：芳氧苯氧丙酸類AOPP和環(huán)己烯酮類CHD。ACCase抑制劑類除草劑主要是抑制乙酰輔酶A羧化成丙二酰輔酶A，導致植物內部的脂肪酸無法合成，細胞膜結構遭到破壞，進而達到破壞植物代謝使其快速死亡的效果[3-4]。

由于ACCase抑制劑對雙子葉植物的高度安全和對禾本科雜草的高效抑制，因此被廣泛用于油菜田、小麥田等田間雜草的防除[5]。長期以來頻繁和廣泛使用除草劑使得油菜田雜草抗藥性問題頻發(fā)。2001年Heap就報道已有11種抗性生物型雜草在油菜田發(fā)現(xiàn)，其中最嚴重的是對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性的野燕麥和狗尾草[6]。我國最早對油菜田雜草看麥娘抗藥性進行報道的是黃世霞，其通過培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法研究發(fā)現(xiàn)部分油菜田看麥娘已對高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗性[7]。王信群研究結果表明油菜田看麥娘已對高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生一定抗性，同時對精喹禾靈產(chǎn)生交互抗性，但對環(huán)己烯酮類的快捕凈無交互抗性[8]。

雜草對除草劑產(chǎn)生抗藥性主要有三大原因[9-10]：一是作用靶標的改變；二是代謝作用的加強；三是除草作用的屏蔽。部分抗ACCase抑制劑類除草劑的雜草通過改變修飾體內的ACCase來達到降低對除草劑敏感性的效果，如Brown[11]等研究發(fā)現(xiàn)，ACCase的異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼釋е驴贷溎飳Νh(huán)己烯酮類除草劑烯禾啶產(chǎn)生抗性；Délye[12]等報道，ACCase在1 781位將異亮氨酸編碼成亮氨酸的突變是看麥娘抗芳氧苯氧基丙酸類除草劑的主要原因。谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)是一個同工酶家族，其可受多種因素誘導，對一些有毒物質，包括農藥、除草劑、致癌物和誘變劑等起到解毒作用[13]，郇志博[14]研究黑龍江省大豆田稗草對精喹禾靈的抗性機理發(fā)現(xiàn)，低水平抗性與GSTs活動增強相關。

油菜田看麥娘對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性的問題已在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)并報道，但目前湖南省境內仍未見相關研究報道，鑒于此，筆者從湖南省內7個市10個地區(qū)的油菜田采集到了11個看麥娘潛在抗藥性生物型，并從南京農業(yè)大學獲得了相應的敏感生物型(未使用過除草劑)，運用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測定了其對精喹禾靈的抗性水平，測定了常德市桃源地區(qū)看麥娘潛在抗藥性生物型以及由南京農業(yè)大學提供的看麥娘敏感生物型谷胱甘肽-S-轉移酶的活性，并通過PCR擴增技術與DNA測序比對研究其抗藥性產(chǎn)生的分子基礎，為科學合理使用該藥提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藥劑： 94%精喹禾靈原藥，京博農化科技有限公司；15.8%精喹禾靈乳油，上海艾科思生物藥業(yè)有限公司。

主要試劑：硝酸鉀、無水乙醇、丙酮、吐溫-80，天津恒興化學試劑有限公司；PVP40，Sigma公司；Tris、L-還原型谷胱甘肽，Ameco公司；考馬斯亮藍、蛋白標準液，南京建成生物工程研究所；Plant Genomic DNA Kit(離心柱型)，TIANGEN公司；10×EasyTaq buffer、dNTP mixture、EasyTaq DNAPloymerase，Trans公司；巰基乙醇、氯仿、Tris平衡酚，Solarbio公司。

主要儀器：智能型人工氣候箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；WM-2天然氣壓縮機，天津儀器；Allegra X-22R 離心機，BECKMAN COULTER； 5804R離心機，德國Eppendorf公司；UV-1240紫外分光光度計，島津公司；PCR擴增儀，Applied Biosystems公司；DYY-6 c型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)，培清科技。

雜草種子：于2013年4-5月在湖南省7個市10個地區(qū)油菜田采集看麥娘潛在抗藥性生物型，敏感種子由南京農業(yè)大學植物保護學院雜草研究室提供，采集地點與用藥歷史見表1。

表1看麥娘采集地點與精喹禾靈用藥歷史

Table1ThecollectingsitesofAlopecurusaequalisandthebackgroundofquizalofop-P-ethyl

采樣地點Collectingsite精喹禾靈應用歷史Backgroundofquizalofop?P?ethyl長沙Changsha長沙縣榔梨鎮(zhèn)約5年芙蓉區(qū)東岸鄉(xiāng)約2年常德Changde安鄉(xiāng)縣深柳鎮(zhèn)約8年鼎城區(qū)石門橋鎮(zhèn)約5年桃源縣陬市鎮(zhèn)約8年漢壽縣五豐村約2年益陽Yiyang南縣浪拔湖鎮(zhèn)約2年瀏陽Liuyang瀏陽市向陽村約3年岳陽Yueyang平江縣長壽鎮(zhèn)約4年婁底Loudi雙峰鎖石鎮(zhèn)約4年永州Yongzhou祁陽縣石鼓源鄉(xiāng)約5年南京Nanjing南京農業(yè)大學未使用除草劑

1.2 方法

1.2.1 看麥娘的抗藥性測定

采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測定看麥娘對精喹禾靈的抗性水平[15]。培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法：稱取53.19 mg的94%精喹禾靈原粉，先用少量丙酮溶解后再用0.1%的吐溫-80水溶液稀釋成系列質量濃度藥液，供試。

在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中進行劑量反應試驗。看麥娘種子用質量分數(shù)為0.2%的硝酸鉀(KNO3)于4 ℃冰箱中低溫處理72 h后，繼續(xù)用去離子水培養(yǎng)至露白，挑選長勢一致的種子各40粒分別置于含有5 mL不同質量濃度藥液和鋪有兩張濾紙的培養(yǎng)皿內，加蓋確保種子處于濕潤狀態(tài)。精喹禾靈的有效成分含量分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/L，以去離子水處理作為空白對照，每個處理重復4次。培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，溫度為白天24 ℃，晚上18 ℃，每天光照12 h。處理7 d后測量芽長，計算抑制率，求出回歸方程。所有數(shù)據(jù)使用DPS軟件處理。

盆栽法：稱取0.03 mL的15.8%精喹禾靈乳油，用去離子水稀釋成系列質量濃度藥液，供試。

在直徑為9 cm的塑料盆缽內，裝入風干、過篩并與營養(yǎng)土混合后的土壤。每盆播種經(jīng)0.2%硝酸鉀處理72 h后培養(yǎng)至露白的看麥娘種子20粒。置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為白天24 ℃，晚上18 ℃，每天光照12 h。出苗后，每盆定苗10株，待看麥娘長至3～4葉期進行莖葉噴霧，噴液量為450 L/hm2。通過預試驗設定精喹禾靈的有效處理劑量為236.88、118.44、59.22、29.61、14.81和7.40 g/hm2，以去離子水溶液處理作為空白對照，每個處理設4次重復。于噴藥后21 d剪取看麥娘地上部分，稱鮮重，計算各處理的鮮重抑制率，使用DPS軟件求出回歸方程。

1.2.2 谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的活性測定[16]

谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的提?。河谑┯镁天`后1～8 d取樣。取看麥娘地上部分0.5 g，剪碎放入預冷的研缽中，加入5 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含還原型谷胱甘肽25 mmol/L，5%PVP)，冰浴勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為酶提取液，以上操作均在-4 ℃條件下進行。

谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的活性測定：于3 mL Tris-HCL緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)中加入0.1 mL酶液，25 ℃保溫10 min，加入0.1 mL無水乙醇配制的13 mmol/L CDNB，反應10 min 后，于 340 nm 處測得A值。以 1 mg/L 蛋白 10 min 催化反應使吸光值改變 0.001為一個酶活力單位，以1 mg/L可溶性蛋白的酶活力單位數(shù)為酶活力。以施藥酶活力與空白對照酶活力的比值為相對活力。各處理重復3次，使用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

1.2.3 ACCase的作用位點PCR擴增、DNA測序及序列分析

選取南京農業(yè)大學敏感品系和常德市桃源地區(qū)潛在抗性品系看麥娘作為供試材料，培養(yǎng)方法同盆栽法，出芽后每盆移種看麥娘20株，出苗后，每盆定苗16株，待各株看麥娘長至3～4葉期即使用Plant Genomic DNA Kit提取DNA。參考黃世霞[17]合成本試驗引物(表2)，用于擴增ACCase的CT區(qū)序列。

表2本試驗中所用引物1)

Table2Theprimersusedinthisstudy

引物名稱Primername引物序列Primersequence目的區(qū)域PositionACVRG15′CTGCAAACATTGGTG?GACCTCTTCCTATTAC3′5816～6872ACVRG1R5′CAGTCGGTGCTTCCTGC?TGCAGCTG3′

1) 目的區(qū)域指位于大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)基因序列(GenBank No.AJ310767)中的位置。

PCR擴增體系包含：Template 2.4 μL，Primer ACVRG1、ACVRG1R各1 μL，10×EasyTaq Buffer 1 μL，dNTP Mixture和EasyTaq(5U/μL)各1 μL，Sterile Ultra-pure Water 36.6 μL。擴增程序如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 45 s，63 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR產(chǎn)物回收、測序均由博尚生物技術(上海)有限公司完成。測序結果由生物軟件Vector NTI進行比對分析。同源性比對在基因數(shù)據(jù)庫NCBI中進行BLAST分析。

2 結果與分析

2.1 看麥娘對精喹禾靈的抗性水平

通過培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法測定看麥娘的抗藥性水平(表3)結果表明，與敏感株系相比，常德桃源采集點的看麥娘對精喹禾靈的抗性水平最高，其抗性倍數(shù)為10.50倍，EC50為2.246 mg/L。其他采集點的抗性倍數(shù)在2.01～7.09之間，抗性水平不明顯。

表3培養(yǎng)皿法測定不同看麥娘生物型對精喹禾靈的抗藥性水平

Table3TheresistancelevelsofdifferentAlopecurusaequalisbiotypestoquizalofop-P-ethyldeterminedbyseedbioassayexperiments

地點Site生物型Biotype回歸方程(y=)Regressionequation相關系數(shù)CorrelationcoefficientEC50(95%置信區(qū)間)/mg·L-1抗藥性指數(shù)Resistanceindex(RI)南京NanjingNJ5．1831+0．2739x0．96590．214(0．060～0．337)1長沙ChangshaCS14．9627+1．4947x0．98691．059(0．431～1．663)4．95CS25．4063+1．8161x0．98560．597(0．273～0．938) 2．79常德安鄉(xiāng)Anxiang，ChangdeAX4．8619+1．0503x0．95041．354(0．191～2．126)6．33常德桃源Taoyuan，ChangdeTY4．6459+1．0075x0．96682．246(0．134～3．528)10．50 常德鼎城Dingcheng，ChangdeDC4．9992+0．8442x0．97431．002(0．147～1．574)4．68常德漢壽Hanshou，ChangdeHS5．1393+0．8533x0．97300．687(0．079～1．078)3．21瀏陽LiuyangLY5．1422+0．9571x0．97390．710(0．140～1．115)3．32永州YongzhouYZ4．8070+1．0649x0．97151．518(0．165～2．384)7．09岳陽YueyangYU5．0363+0．4882x0．97420．843(0．017～1．323)3．94婁底LoudiLD5．0025+0．8517x0．96170．993(0．121～1．560)4．64益陽YiyangYY5．1942+0．5131x0．95260．418(0．006～0．657)2．01

盆栽法結果(表4)表明，常德桃源采集點的看麥娘對精喹禾靈的抗性水平較高，其抗性倍數(shù)為25.30倍，EC50為81.801 g/hm2，其他采集點的抗性倍數(shù)在2.43～9.47倍，尚未產(chǎn)生明顯抗性。

表4整株法測定不同看麥娘生物型對精喹禾靈的抗藥性水平

Table4TheresistancelevelsofdifferentAlopecurusaequalisbiotypestoquizalofop-P-ethylbywhole-plantbioassay

地點Site生物型Biotype回歸方程(y=)Regressionequation相關系數(shù)CorrelationcoefficientEC50(95%置信區(qū)間)/g·hm-2抗藥性指數(shù)Resistanceindex(RI)南京NanjingNJ4．2605+1．4400x0．96983．262(0．001～5．123)1長沙ChangshaCS12．0724+2．3700x0．985017．190(4．521～26．994)5．27CS23．2962+1．7920x0．95128．929(0．733～14．022)2．74常德安鄉(xiāng)Anxiang，ChangdeAX2．6334+1．7358x0．994523．091(0．533～36．262)7．08常德桃源Taoyuan，ChangdeTY4．4674+0．2785x0．972281．801(0．001～128．458)25．30常德鼎城Dingcheng，ChangdeDC1．9851+2．4640x0．973816．734(5．360～26．278)5．13常德漢壽Hanshou，ChangdeHS2．5616+2．1910x0．979512．971(2．689～20．369)3．98瀏陽LiuyangLY2．0763+2．4608x0．964715．421(5．321～24．216)4．73永州YongzhouYZ2．3097+1．8060x0．994630．877(0．292～48．489)9．47岳陽YueyangYU2．0995+2．5800x0．956813．311(4．131～20．903)4．08婁底LoudiLD2．5331+1．8856x0．991020．338(4．819～31．938)6．23益陽YiyangYY2．3849+2．9103x0．99367．917(0．602～12．433)2．43

2.2 精喹禾靈對抗性和敏感生物型看麥娘GSTs活力的影響

經(jīng)精喹禾靈處理后，抗藥性生物型看麥娘的GSTs活力即開始上升，至第5天達到最高值，為同期對照的1.27倍，隨后GSTs活力開始下降，至第8天回落至同期對照水平；敏感生物型看麥娘GSTs活力在施藥后開始下降，至第3天開始回升，第6天達到最高水平，為同期對照的1.12倍，第7天基本回落至對照水平，第8天降至對照水平以下。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型GSTs活力在第5天顯著高于敏感生物型GSTs活力，第1～4天及第6～8天兩者并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(圖1)。

圖1 精喹禾靈對看麥娘GSTs的影響

2.3 ACCase作用位點的序列分析

利用引物ACVRG1、ACVRG1R進行擴增，得到南農敏感生物型和桃源抗藥性生物型看麥娘ACCase基因CT區(qū)的部分序列,擴增片段大小約為1 053 bp。在基因數(shù)據(jù)庫NCBI中經(jīng)BLAST分析比較，發(fā)現(xiàn)該序列與大穗看麥娘ACCase基因(GenBank No. AJ310767)序列同源性達90%，確定該擴增序列為看麥娘的ACCase基因部分序列。將擴增所得抗性及敏感生物型看麥娘氨基酸序列用Vector NTI11.5比對發(fā)現(xiàn)，抗藥性生物型氨基酸序列在第93位比敏感生物型多一個丙氨酸(圖2)。

圖2 抗性及敏感生物型看麥娘靶標位點氨基酸序列比較(用引物ACVRG1、ACVRG1R擴增所得)

3 討論

本研究采用培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法和盆栽法測定了湖南省境內7個市10個地區(qū)采集點看麥娘對精喹禾靈的抗藥性水平，兩種測定方法結果均顯示常德市桃源地區(qū)的抗性水平達到中等程度，其他地區(qū)采集點看麥娘對精喹禾靈尚未產(chǎn)生明顯抗性，這一結果可能與桃源地區(qū)用藥時間長于其他地區(qū)有關。明確各地油菜田看麥娘對精喹禾靈的抗藥性水平，對制定化學防除方案及合理施用藥劑有重要意義。此外，本研究中盆栽法抗性倍數(shù)普遍高于培養(yǎng)皿種子萌發(fā)法抗性倍數(shù)，其原因可能是培養(yǎng)皿法是在雜草幼苗期施藥，而溫室栽培法是在雜草3～5葉期施藥，隨著雜草自身的生長，其解毒代謝能力不斷增強，故后者的抗性倍數(shù)要高于前者。

谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)是一類重要的解毒酶，它可以催化谷胱甘肽與多種疏水化合物的親電子基團相連接，這種連接方式是生物體進行脫毒和排毒的重要方式[18]。研究結果顯示，桃源地區(qū)看麥娘GSTs活力在第5天顯著高于敏感品系看麥娘，表明其對精喹禾靈產(chǎn)生中等抗藥性的原因之一為其代謝酶GSTs代謝能力的增強，這與其他相關禾本科雜草對ACCase抑制劑產(chǎn)生抗藥性的研究結論基本一致[19-20]。Li Lingxu[21]等研究發(fā)現(xiàn)，第1 781位異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼崾菍е蔓溙镓璨輰珢哼蚝滩蒽`產(chǎn)生抗藥性的主要原因；Tang Huaiwu[22]等報道，日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗藥性主要可能是由4個核苷酸突變導致的，包括甘氨酸取代1 734位精氨酸，絲氨酸取代1 739位蘇氨酸，亮氨酸取代1 738位蛋氨酸，以及天冬酰胺取代2 041位異亮氨酸；湯懷武[23]報道，抗性和敏感生物型日本看麥娘ACCase基因序列存在11處差異。本研究結果顯示，抗藥性生物型植株的氨基酸序列在第93位比敏感生物型多一個丙氨酸，但考慮到抗藥性生物型與敏感生物型來自不同生態(tài)區(qū)，遺傳背景可能不同，因此其氨基酸序列的突變是由于其遺傳背景不同導致還是抗性水平差異造成仍需進行進一步驗證。

本試驗從精喹禾靈對看麥娘GSTs活性影響和靶標位點基因的改變兩個角度來闡述抗性產(chǎn)生的機理，但抗性的產(chǎn)生是否涉及其他酶系的作用以及相關靶標基因表達量的改變還有待進一步研究。

[1]孫丙耀. 麥田看麥娘屬雜草種群消長原因及其抗性鑒定的研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學,1996.

[2]黃世霞, 王慶亞, 張守棟. 看麥娘生物學特性研究[J]. 江蘇農業(yè)科學,2006(4):58-60.

[3]Sasaki Y, Nagano Y. Plant acetyl-CoA carboxylase: structure, biosynthesis, regulation, and gene manipulation for plant breeding[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,2004,68(6):1175-1184.

[4]郭峰, 張朝賢, 黃紅娟, 等. 雜草對ACCase抑制劑的抗性[J]. 雜草科學, 2011,29(3):1-6.

[5]黃世霞, 王慶亞, 董立堯, 等. 乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑與雜草的抗藥性[J]. 雜草科學, 2003(2): 1-5.

[6]Heap I, LeBaron H, Powles S B, et al. Introduction and overview of resistance[M]∥Powles S B, Shaner D L. Herbicide Resistance and World Grains. CRC Press, 2001: 1-22.

[7]黃世霞, 王慶亞, 張守棟. 油菜田看麥娘對高效蓋草能產(chǎn)生抗藥性的現(xiàn)狀研究[J]. 安徽農業(yè)科學,2006,34(9):1913-1914.

[8]王信群, 黃世霞, 李楠. 油菜田看麥娘對10.8%高效蓋草能抗性及對幾種除草劑交互抗性的研究[J]. 安徽農業(yè)科學, 2006,34(16): 4022-4023.

[9]Heap I M. The occurrence of herbicide-resistant weeds worldwide[J]. Pesticide Science, 1997, 51(3): 235-243.

[10]張朝賢, 倪漢文, 魏守輝, 等. 雜草抗藥性研究進展[J]. 中國農業(yè)科學, 2009,42(4):1274-1289.

[11]Brown A C, Moss S R, Wilson Z A, et al. An isoleucine to leucine substitution in the ACCase ofAlopecurusmyosuroides(black-grass) is associated with resistance to the herbicide sethoxydim[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology,2002,72(3):160-168.

[12]Délye C, Wang T, Darmency H. An isoleucine-leucine substitution in chloroplastic acetyl-CoA carboxylase from green foxtail (SetariaviridisL. Beauv.) is responsible for resistance to the cyclohexanedione herbicide sethoxydim[J]. Planta,2002,214(3):421-427.

[13]郭玉蓮, 陶波, 鄭鐵軍, 等. 植物谷胱甘肽-S-轉移酶 (GSTs) 及除草劑解毒劑的誘導作用[J]. 東北農業(yè)大學學報,2008,39(7):136-139.

[14]郇志博. 黑龍江省大豆田稗草對精喹禾靈的抗性研究[D]. 山東：山東農業(yè)大學,2011.

[15]陳宏州, 楊敬輝, 朱桂梅, 等. 油菜田日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的抗藥性檢測[J]. 西南農業(yè)學報, 2012,25(2):502-506.

[16]吳進才, 許俊峰, 馮緒猛, 等. 稻田常用農藥對水稻3個品種生理生化的影響[J]. 中國農業(yè)科學, 2003,36(5):536-541.

[17]黃世霞, 何金鈴, 王慶亞, 等. 看麥娘對稀禾啶和高效氟吡甲禾靈產(chǎn)生抗藥性的分子基礎[J]. 激光生物學報, 2010,19(6):832-837.

[18]Cobb A H, Kirkwood R C. Herbicides and their mechanisms of action[M]. England：Sheffield Academic Press,2000.

[19]韓瑞娟, 董立堯, 李俊, 等. 日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究[J]. 雜草科學,2010(1):3-7.

[20]Reade J P H, Milner L J, Cobb A H. A role for glutathione S-transferases in resistance to herbicides in grasses[J]. Weed Science,2004,52:468-474.

[21]Li Lingxu, Bi Yaling, Liu Weitang, et al. Molecular basis for resistance to fenoxaprop-p-ethyl in American sloughgrass (BeckmanniasyzigachneSteud.)[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2013,105(2):118-121.

[22]Tang Huaiwu, Li Jun, Dong Liyao, et al. Molecular bases for resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitor in Japanese foxtail (Alopecurusjaponicus)[J]. Pest Management Science,2012,68(9):1241-1247.

[23]湯懷武. 日本看麥娘(Aloecurusjaponicus)對高效氟吡甲禾靈靶標酶與代謝酶抗性機理研究[D]. 南京：南京農業(yè)大學, 2012.

ResistancelevelofAlopecurusaequalistoquizalofop-P-ethylinrapeinHunanProvince

Zhu Weiwei1, Liu Yiwu1, Liu Xiangying1, Luo Kun1, Bai Lianyang1, 2

(1.InstituteofPesticides,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;2.HunanAcademyofAgriculturalSciences,Changsha410128,China)

In order to investigate the resistance level and mechanism ofAlopecurusaequalisSobol. to quizalofop-P-ethyl in rape, 10 potential resistant biotypes were collected from 7 cities in Hunan Province and the susceptible biotype was obtained from Nanjing Agricultural University. The resistance level ofA.aequalisto quizalofop-P-ethyl was assessed by two methods: seed bioassay and whole-plant bioassay. The enzymology mechanism of Taoyuan Town potential resistant biotype and Nanjing Agricultural University susceptible biotype was studied with the important metabolic enzyme glutathione-s-transferase(GSTs), and the resistance mechanism at the molecular level was detected by using PCR technology and comparing the amino acid sequences of resistant and sensitive plants. The results of seed bioassay showed that the relative resistance factor of Taoyuan Town in Changde was 10.50, which was the highest. The resistance factor of all of the other potential resistant biotypes ranged from 2.01 to 7.09, which was sensitive to quizalofop-P-ethyl. The results of whole-plant bioassay showed that the relative resistance factor of the biotype from Taoyuan Town in Changde was 25.30, while the factors of other potential resistant biotypes were from 2.43 to 9.47. The GST activity of resistant biotypes was obviously higher than that of the susceptible biotype on the fifth day, indicating that the difference in the metabolic ability of GSTs to quizalofop-P-ethyl was an important reason for the resistance to quizalofop-P-ethyl. The comparison of ACCase sequences between the resistant and sensitive biotypes showed that the amino acid sequence of resistant biotype had one additional Ala, but further verification is needed to figure out the relationships between resistance level and target gene’s mutation.

rape field;Alopecurusaequalis; quizalofop-P-ethyl; herbicide resistance

2014-01-08

：2014-03-25

公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201303031)

S 481.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.014

* 通信作者 E-mail: bailianyang2005@aliyun.com