苜蓿銹菌夏孢子的生物學特性及殺菌劑對其室內毒力測定

雒富春， 袁慶華， 王 瑜， 沈慧敏*

(1.甘肅農業大學草業學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

苜蓿銹菌夏孢子的生物學特性及殺菌劑對其室內毒力測定

雒富春1， 袁慶華2*， 王 瑜2， 沈慧敏1*

(1.甘肅農業大學草業學院，蘭州 730070；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

采用孢子萌發法對引起苜蓿銹病的病原菌進行了生物學特性研究，并采用不同的殺菌劑進行了室內毒力測定。研究表明：在100%相對濕度下，苜蓿銹菌夏孢子在5～30 ℃都能萌發，但溫度在20～25 ℃萌發最快；光照和1%葡萄糖液有促進孢子萌發的作用；不同殺菌劑室內毒力測定研究表明，吡唑醚菌酯和嘧菌酯效果最好，其EC50分別為0.040 1、0.068 1 mg/L。

苜蓿銹病； 生物學特性； 殺菌劑； 毒力測定

苜蓿是世界分布最廣泛的牧草，號稱“牧草之王”[1-2]，不僅產量高，而且草質優良，為各種畜禽所喜食[3]。隨著苜蓿產業的發展，苜蓿種植面積不斷擴大，苜蓿病害問題越來越嚴重，特別是苜蓿銹病(alfalfa rust)在我國的東北、內蒙古、河北、甘肅和新疆等地區發生和危害較為嚴重，對苜蓿生產造成嚴重的經濟損失[4-5]。

苜蓿銹病是由苜蓿銹菌(UromycesstriatusSchroet)引起的[6-7]，目前有關該菌的生物學特性、致病力及殺菌劑對其夏孢子的影響的報道較少[8]。因此，本文通過研究引起苜蓿銹病的夏孢子的生物學特性及不同殺菌劑對其室內毒力測定，篩選對銹菌夏孢子敏感的抑孢殺菌劑，為苜蓿銹病的發生規律研究和化學防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 苜蓿銹菌夏孢子生物學特性

1.1.1 供試菌種及來源

供試菌種：2012年秋采自中國農業科學院廊坊牧草試驗基地。

將采集到的帶有苜蓿銹菌的新鮮葉片用0.1%吐溫水溶液清洗，配制成在低倍鏡下觀察每視野40～60個夏孢子的懸浮液備用。

1.1.2 溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

采用水瓊脂玻片法[9]研究不同溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響。設置5、10、15、20、25、30、35 ℃共7個溫度處理，將帶有銹菌夏孢子的水瓊脂玻片置入帶有濕濾紙的培養皿中，然后放入可控溫度氣候培養箱，每個處理重復3次。由于超過12 h，其孢子萌發芽管交錯復雜，很難統計，因此本試驗在12 h內統計萌發率(下同)。每4 h觀察1次，共觀察3次，每次記錄孢子萌發數和孢子總數，每重復調查孢子數不少于300個。

1.1.3 光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

方法如1.1.2，在20 ℃下分別設置全光照、2 h光暗交替和全黑暗3個處理，每處理重復3次，每4 h觀察1次，共觀察3次，分別記錄孢子萌發數和孢子總數，每重復調查孢子數不少于300個。

1.1.4 不同環境物質對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

方法如1.1.2，在20 ℃下設置無菌蒸餾水、1%葡萄糖液、0.5%葡萄糖液、0.1%葡萄糖液、10%苜蓿葉片榨汁液、20%苜蓿葉片榨汁液共6個處理，每個處理重復3次，每4 h觀察1次，共觀察3次，記錄數據并計算孢子萌發率，每重復調查孢子數不少于300個。

1.1.5 數據處理

利用公式(1)計算孢子萌發率，利用SPSS19.0、Excel等軟件進行顯著性分析。

1.2 不同藥劑對苜蓿銹菌夏孢子室內毒力測定

1.2.1 供試藥劑

供試藥劑及來源見表1。

1.2.2 藥劑處理及濃度的配制

首先將供試藥劑用二甲基亞砜溶解配制成20 000 mg/L的母液，再用丙酮溶解并稀釋成濃度為100、20、5、1、0.2 mg/L的溶液(制劑按有效成分計算)備用。

1.2.3 調查和數據處理

每個處理設置3個重復，同時用無菌蒸餾水作空白對照。12 h后，當空白對照孢子萌發率達到90%以上時，調查藥劑處理孢子萌發率，每重復隨機調查孢子總數不少于300個，分別記錄萌發數和孢子總數，計算孢子萌發率、校正萌發率、相對抑制萌發率，使用DPS 6.55軟件計算EC50、EC90，進行毒力回歸分析等。

藥劑處理校正夏孢子萌發率(%)=

夏孢子萌發相對抑制率(%)=

表114種殺菌劑及來源

Table1Fourteenfungicidesandtheirsources

藥劑Fungicide來源Source95%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC上海禾本藥業有限公司97．7%咪鮮胺TC97．7%ProchlorazTC江蘇南通江山農藥化工股份有限公司95%福美雙TC95%Arasan河北冠龍農化有限公司96．2%烯酰嗎啉TC96．2%DimethomorphTC山東先達農化股份有限公司95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC巴斯夫歐洲公司97%異菌脲TC97%IprodioneTC江蘇蘭豐生物化工有限公司96．2%嘧霉胺TC96．2%PyrimethanilTC浙江禾本科技有限公司95%百菌清TC95%ChlorothalonilTC山東大成農化有限公司96%三唑酮TC96%TriadimefonTC江蘇省鹽城利民農化有限公司97%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC上海生農生化有限公司97%苯醚甲環唑TC97%DifenoconazoleTC上海生農生化有限公司50%多菌靈WP50%CarbendazimWP江蘇江陰市福達農化有限公司70%甲基硫菌靈WP70%Thiophanate?methylWP江蘇江陰市福達農化有限公司80%代森錳鋅WP80%MancozebWP河北青園農藥有限公司

2 結果與分析

2.1 溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

由表2可知，夏孢子在5～30 ℃之間都可以萌發，但超過25 ℃時，隨著溫度的升高夏孢子的萌發率逐漸下降，當達到35 ℃時，夏孢子失活，不萌發。從萌發時間看，在4 h時，夏孢子在5～25 ℃都能萌發并且隨著溫度的升高萌發率逐漸升高，20和25 ℃的萌發率極顯著高于其他溫度的萌發率；在8 h，20～25 ℃時，其萌發率顯著高于其他處理；在12 h，10～25 ℃的萌發率顯著高于30 ℃和5 ℃，達90%以上。

2.2 光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

不同光照處理對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響見表3，孢子萌發初期(4 h)，全光照和2 h光暗交替對夏孢子萌發有一定的促進作用，其萌發率顯著高于黑暗條件下，而隨著時間的延長，當孢子萌發時間達到8 h或以上時，黑暗條件下的萌發率和光照條件下萌發率差異不顯著，均達90%以上。

表2不同溫度對苜蓿銹菌夏孢子萌發率的影響1)

Table2Effectsoftemperatureonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

溫度/℃Temperature萌發率/%Germinationrate4h8h12h531．99eD74．70cC88．02bB1044．35dC88．44bB93．81aA1570．56bB88．62bB93．20aA2085．58aA93．24aA94．80aA2589．79aA93．25aA95．33aA3054．58cC73．27cC81．43cC350fE0dD0dD

1) 表中同列數據后不同小寫英文字母表示在0.05水平差異顯著；大寫英文字母表示在0.01水平差異顯著。下同。
Different lower-case letters in the same column indicate significant difference (P<0.05) and capital letters indicate highly significant difference (P<0.01).The same below.

表3光照對苜蓿銹菌夏孢子萌發率的影響

Table3Effectsoflightonthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

光照條件Lightcondition萌發率/%Germinationrate4h8h12h暗Dark72．40bB92．24aA94．11aA光Light90．90aA95．02aA94．97aA2h光暗交替Alternationoflightanddarkfor2h86．79aA93．95aA95．32aA

2.3 環境物質對苜蓿銹菌夏孢子萌發的影響

由表4可知，不同濃度的葡萄糖液和無菌蒸餾水處理的孢子萌發率相對較高，在12 h分別達96.02%、95.17%、94.11%和94.24%，而葉片榨汁液處理萌發率相對較低，10%和20%葉片榨汁液處理萌發率在12 h僅為84.80%和74.49%。從時間上看，各個處理的夏孢子基本在前8 h萌發，8 h后孢子萌發數較少，其中1%葡萄糖液在前4 h萌發最快，其萌發率已達93.38%，其次是0.5%葡萄糖液(91.03%),兩者均極顯著高于相同時間其他處理的萌發率，而在8、12 h時與低濃度的葡萄糖液處理以及蒸餾水處理差異不顯著。表明在孢子萌發初期，相對較高濃度的葡萄糖液有促進孢子萌發的作用。

表4環境物質對苜蓿銹菌夏孢子萌發率的影響

Table4Effectsofnutritiononthegerminationrateofuredosporesofalfalfarust

處理Treatment萌發率/%Germinationrate4h8h12h無菌蒸餾水Steriledistilledwater84．27abB92．97bAB94．24aA1%葡萄糖1%Glucose93．38aA95．13aA96．02aA0．5%葡萄糖0．5%Glucose91．03aA93．61abAB95．17aA0．1%葡萄糖0．1%Glucose82．94bB91．64bB94．11aA10%榨汁液10%Laminasqueeze79．28cB84．15cC84．80bB20%榨汁液20%Laminasqueeze66．76dC71．81dD74．49cC

2.4 不同殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子室內毒力測定

從不同藥劑的EC50(表5)可以看出，吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美雙、百菌清、代森錳鋅、戊唑醇、苯醚甲環唑對苜蓿銹菌夏孢子有不同程度的抑制作用，共有3種殺菌劑的EC50<1 mg/L，分別為吡唑醚菌酯、嘧菌酯、福美雙，其中吡唑醚菌酯的抑制作用最強，EC50為0.040 1 mg/L。由毒力回歸方程的斜率反映藥劑的敏感度可知，在供試的殺菌劑中，嘧菌酯最為敏感。而咪鮮胺、異菌脲、嘧霉胺、三唑酮、烯酰嗎啉、多菌靈和甲基硫菌靈在設置的濃度范圍內幾乎對夏孢子的萌發沒有抑制作用，表明這7種殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子不敏感。

表5不同殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子的室內毒力測定

Table5Toxicitymeasurementofdifferentfungicidesonofalfalfarusturedospores

藥劑TestedpesticideEC50/mg·L-1EC90/mg·L-1相關系數Correlationcoefficient毒力回歸方程(y=)Regressionequation95%吡唑醚菌酯TC95%PyraclostrobinTC0．04010．08860．93043．7217x+10．199395%嘧菌酯TC95%AzoxystrobinTC0．06810．12810．96614．6667x+10．445895%福美雙TC95%ArasanTC0．19270．76880．90392．1324x+0．326295%百菌清TC95%ChlorothalonilTC1．75694．28820．95553．3070x+4．190680%代森錳鋅WP80%MancozebWP2．019050．48530．89870．9167x+4．720397%戊唑醇TC97%TebuconazoleTC2．863935．58840．94381．1711x+4．464997%苯醚甲環唑TC97%DifenoconazoleTC7．780223．89860．83252．6295x+2．2658

3 結論與討論

通過對苜蓿銹菌夏孢子生物學特性的研究及室內毒力測定，結果表明在100%的相對濕度下且在水膜中，苜蓿銹菌夏孢子在5～30 ℃范圍內均能萌發，其最適萌發溫度為15～25 ℃，當溫度達到30 ℃時，夏孢子雖能萌發但產生高度扭曲的畸形芽管，溫度達到或超過35 ℃時，夏孢子基本上失活，不萌發，這和余仲東等人[10]研究溫度對松楊柵銹菌夏孢子萌發影響的結果具有相似性，松楊柵銹菌夏孢子在低于5 ℃和高于30 ℃時不萌發。不同環境物質對夏孢子萌發的影響研究中可以發現，1%葡萄糖液有利于夏孢子萌發，在4 h萌發率達93.38%，顯著高于無菌蒸餾水處理的萌發率，而榨汁液萌發率顯著低于無菌蒸餾水處理的萌發率，反映了對夏孢子萌發產生了一定的抑制作用，造成這種原因可能與葉片浸出液中含有一些氧化物、酚類物質有關[11]，郭志青等人[12]在研究落葉松楊柵銹菌夏孢子時也發現，適量的糖分能夠促進夏孢子的萌發，但較高濃度的葉片浸出液反而影響孢子的萌發；在研究光照對夏孢子萌發的影響時發現，在孢子萌發初期，溫度在25 ℃時光照對孢子萌發沒有影響，而當溫度在20 ℃時，光照、光暗交替、黑暗條件下在4 h的孢子萌發率分別為90.90%、86.79%、72.40%，可以看出光照對孢子萌發有一定的促進作用，這和梁巧蘭[13]等人研究康乃馨銹菌夏孢子生物學特性時得出的光照抑制孢子萌發的結論略有不同，這可能是由于不同種銹菌夏孢子生物學特性有所差異，然而隨著萌發時間的加長，在12 h各個光照條件處理的萌發率分別達到94.97%、95.32%和94.11%，差異不顯著，因而可以看出在相對較低溫度下，光照對夏孢子萌發初期產生一定的促進作用。

有關銹菌毒力測定的研究，20世紀90年代周淑清等[14]在研究影響苜蓿銹菌夏孢子萌發的因素時發現，多效唑和翠竹牌植物生長劑對孢子的萌發有顯著的抑制作用，但并沒有進行多種殺菌劑的毒力測定。薛明珍等[15]通過小麥活體接種的方法研究小麥銹病防治時，發現丙環唑有較好的效果但其對孢子萌發是否有抑制作用未進行研究說明。本試驗進行了14種殺菌劑對苜蓿銹菌夏孢子萌發的毒力測定，研究表明甲氧基丙烯酸類殺菌劑吡唑醚菌酯、嘧菌酯對銹菌夏孢子有較好的抑制作用，對銹菌夏孢子毒力測定EC50分別為0.040 1和0.068 1 mg/L，同時福美雙、百菌清和代森錳鋅在較低濃度也對夏孢子萌發有較好的抑制作用，因而在實際防治過程中這些藥劑可以輪換使用，以免單一藥劑的長時間使用產生抗藥性問題。但此次藥劑試驗中，僅在室內做了毒力測定，篩選出了幾種效果較好的抑孢殺菌劑，尚未得到室外或大田試驗的驗證，所以上述幾種殺菌劑對苜蓿銹菌的抑菌作用還有待于進一步的明確，以便更科學地指導大田苜蓿銹病的有效防治。

綜上所述，在苜蓿銹病防治過程中，應該充分考慮其生物學特性。由夏孢子生物學特性可知，在高溫情況下銹病不發生，一般發生在溫度較低和濕度較大的春季或秋季，因此，每年應該在春季和秋季對各苜蓿種植區銹病的發生動態提前做好監控或預報，盡量在銹病潛育期或是發生前期進行藥劑防治，以防大面積發生，造成不必要的損失。

[1]耿華珠.中國苜蓿[M].北京:中國農業出版社,1995:114-117.

[2]黃寧,盧欣石.苜蓿葉部和根部病害研究的評價進展[J]. 中國農學通報,2012,28(5):1-7.

[3]南志標.建立中國的牧草病害可持續管理體系[J].草業學報,2000,9(2):19-21.

[4]南志標.銹病對紫花苜蓿營養成分的影響[J].中國草原與牧草,1985,2(3):33-35.

[5]袁慶華.我國苜蓿病害研究進展[J].植物保護,2007,33(1):6-11.

[6]王雪薇,喻寧莉,馬德成,等.新疆苜蓿病害種類和分布的初步研究[J].草業學報,1998,7(2):48-52.

[7]侯天爵,周淑清,劉一凌,等.苜蓿銹病的發生、危害與防治[J].內蒙古草業,1996(11):11-13.

[8]Webb D H,JrNutter F W.Effects of leaf wetness duration and temperature on infection efficiency, latent period, and rate of pustule appearance of rust in alfalfa[J].Phytopathology,1997,87(9):946-950.

[9]黃昌華.用瓊脂玻片法測定孢子萌發率[J].植物保護,1993,19(3):36-37.

[10]余仲東,李秀信,郭志青,等.溫度和葉表化學物質對松楊柵銹菌夏孢子萌發的影響[J].東北農業大學學報,2010,38(7):109-112.

[11]Johson J D, Yong K. The role of leaf chemistry inMelampsoramedusaeinfection of hybrid poplar: Effect s of leaf development and fungicide treatment[J]. Canadian Journal of Forest Research, 2005, 35(4):763-771.

[12]郭志青,曹支敏,余仲東,等.落葉松楊柵銹菌夏孢子萌發條件研究[J].西北林學院學報,2010，25(3):118-121.

[13]梁巧蘭,陳剛,徐秉良,等.康乃馨銹病病原生物學特性研究[J].植物保護,2013,39(4):56-60.

[14]周淑清,侯天爵,白儒,等.影響苜蓿銹病夏孢子萌發因素的研究[J].中國草地,1996(6):48-50.

[15]薛明珍,閆佳會,姚強,等.95%丙環唑對小麥銹菌的室內抑制作用研究[J].青海大學學報,2013,31(2):13-16.

Biologicalcharacteristicsoftheuredosporesofalfalfarustandtoxicitytestofdifferentfungicidesinthelaboratory

Luo Fuchun1, Yuan Qinghua2， Wang Yu2， Shen Huimin1

(1.PrataculturalCollegeofGansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

The biological characteristics of the uredospores of alfalfa rust were studied using the uredospores germination method. The results showed that the most suitable temperature for germination was 20-25 ℃ under 100% relative humidity；light and 1% glucose solution had promotion effect on spore germination. The toxicity test showed that pyraclostrobin and azoxystrobin had good effects on the uredospores of alfalfa rust, with an EC50value of 0.040 1 mg/L and 0.068 1 mg/L, respectively.

alfalfa rust; biological characteristics; fungicide; toxicity test

2013-11-06

：2013-12-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAD17B01)；公益性行業(農業)科研專項(201303057)

S 435.4

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.017

* 通信作者 E-mail: yuanqinghua@hotmail.com; ndshm@gsau.edu.cn