離體水稻葉片劃傷接種鑒定稻瘟菌的致病型

張海旺， 房文文， 劉翠翠， 趙文生， 彭友良*

(1.中國農業大學植物病理學系,農業部植物病理學重點開放實驗室， 北京 100193；2.遼寧省農業科學院植物保護研究所， 沈陽 110161)

離體水稻葉片劃傷接種鑒定稻瘟菌的致病型

張海旺1,2， 房文文1， 劉翠翠1， 趙文生1， 彭友良1*

(1.中國農業大學植物病理學系,農業部植物病理學重點開放實驗室， 北京 100193；2.遼寧省農業科學院植物保護研究所， 沈陽 110161)

抗瘟品種的培育和抗瘟基因布局需要快速、準確、大規模地定性水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌致病型。為此，本研究建立了水稻離體葉片劃傷接種方法。該方法依據主效抗瘟基因抵抗稻瘟菌在寄主體內擴展的特點，通過針刺在水稻葉片上造成傷口，避免了寄主侵入抗性的干擾，從而有利于抗擴展性的定性鑒定。作者利用活體噴霧接種、葉片無劃傷接種和本研究建立的離體葉片劃傷接種等3種接種方法，在秧苗4～6葉齡期，對菌株12-DG-68在24個水稻抗瘟單基因系上的致病反應進行了測定，結果顯示：葉片劃傷接種的檢測結果穩定、一致；而葉片無劃傷接種和活體噴霧接種的檢測結果假抗性比例分別為12.5%和4.2%，不同葉齡期的葉片間反應型不一致率達7%。此外，離體葉片劃傷接種還可利用菌絲塊接種，以鑒定分生孢子產量低的菌株的致病型。因此，水稻葉片劃傷接種是一種準確、穩定和方便的稻瘟菌接種方法，可用于大規模定性測定水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌的致病型。

稻瘟病； 品種抗瘟性； 抗性鑒定； 致病型

由稻瘟菌(Magnaportheoryzae)引發的稻瘟病是一種在國內外各稻區經常廣泛發生的嚴重病害，利用抗瘟品種是最經濟、安全、有效的控制稻瘟病策略[1]。為了使抗瘟品種得到持久化利用，需要大規模、廣泛鑒定水稻品種的抗瘟基因型和病菌的無毒基因型，并根據田間稻瘟菌的優勢無毒基因型，科學合理地布局不同抗瘟基因型的水稻品種。當前水稻品種葉瘟抗性鑒定的方法主要有水稻活體噴霧接種[2]和葉片無劃傷接種[3]。然而，這2種方法均有局限性，有時鑒定結果不準確。為此，我們改進了現有的稻瘟菌接種方法，建立了一種新的稻瘟菌接種方法——水稻離體葉片劃傷接種法。

本研究建立的水稻離體葉片劃傷接種法依據主效抗瘟基因抵抗稻瘟菌在寄主體內擴展的特點，通過針刺離體水稻葉片造成傷口，避免了寄主侵入抗性的干擾，從而有利于抗擴展性的定性鑒定。為了證明該方法的有效性和可靠性，作者在秧苗4～6葉齡期，分別利用活體噴霧接種、葉片無劃傷接種和離體葉片劃傷接種等3種方法，對24個水稻抗瘟單基因系接種了稻瘟菌田間菌株12-DG-68，并觀察和比較了上述3種接種方法所產生寄主反應型的差異。結果顯示，本研究建立的離體葉片劃傷接種法可準確、穩定地鑒定寄主水稻的抗、感病反應，從而有助于準確確定稻瘟菌的致病型。

1 材料與方法

1.1 供試水稻品種(系)和稻瘟菌菌株

水稻品種(系)：‘麗江新團黑谷’(LTH);24個水稻抗瘟單基因系[4]，其種子由中國農業科學院作物科學研究所雷財林研究員提供。

稻瘟菌菌株：12-DG-68，由作者在遼寧省東港市稻田分離，并保存。

1.2 稻瘟菌致病型檢測

1.2.1 水稻離體葉片劃傷接種及其操作流程

接種前準備盛放待測水稻葉片的培養皿。將濾紙裁剪成直徑約8 cm的圓片，把2～3層滅菌濾紙片平鋪于直徑為9 cm的塑料培養皿內，添加自來水浸濕濾紙片，去掉培養皿內的流動水。將兩根滅菌牙簽放入培養皿內用于搭放水稻葉片，牙簽間距約2～3 cm。

本接種方法采用0.02%(V/V)的Tween 20溶液[3]配制稻瘟菌分生孢子懸浮液，將分生孢子濃度調整為2×105個/mL用于接種。

采用4～6葉齡期的水稻秧苗，當秧苗心葉90%展開時，剪取其中下部長約5 cm的葉段，用解剖針在主脈劃2～3個傷口且不穿透葉片，將其放到牙簽上，再噴灑0.02%(V/V)Tween 20溶液在葉片上形成一層霧滴，將5～10 μL分生孢子懸浮液滴加到葉片傷口上。或從燕麥片番茄培養基上培養的菌落沿邊緣取約0.5 cm×0.5 cm的菌絲塊，將菌絲面向下平放在葉片傷口處。接種后的水稻葉于25～28 ℃、100%相對濕度下黑暗放置30～32 h，然后在25～28 ℃光照放置72～96 h，隨時觀察已接種水稻葉片癥狀并記錄病斑類型，以接種0.02%(V/V)Tween 20溶液的處理為對照，每個處理重復3次。

1.2.2 水稻葉片無劃傷接種和活體噴霧接種

水稻葉片無劃傷接種參考文獻[3]的方法，水稻秧苗4葉齡時取其最嫩的葉片，將其截成長約5 cm的葉段并放到培養皿內，在葉片上噴施0.02%(V/V)Tween20溶液然后接種稻瘟菌分生孢子懸浮液，分生孢子懸浮液濃度以及接種后水稻葉片的處理方法與葉片劃傷接種法相同，每個處理重復3次。水稻活體噴霧接種參考文獻[5]的方法，4葉齡的水稻秧苗用于接種，接種后5～7 d調查病斑類型，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 水稻葉片劃傷接種、葉片無劃傷接種和活體噴霧接種效果比較

為了證明水稻葉片劃傷接種方法的有效性，我們采用葉片劃傷接種、葉片無劃傷接種和活體噴霧接種3種接種方法分析了菌株12-DG-68在水稻抗瘟單基因系‘IRBLta-K1’、‘IRBLz-Fu’、‘IRBL9-W’和‘LTH’上的致病型。采用葉片劃傷接種，水稻葉片接種后約120 h時，接種處病斑清晰可辨(圖1)。病斑有親和性病斑和非親和性病斑兩種類型，親和性病斑呈梭形，沿接種點向周圍蔓延，病斑中心呈灰色，灰色區域外是黃色暈圈，記錄為S，例如12-DG-68在‘IRBL9-W’和‘LTH’上形成的病斑；非親和性病斑呈褐色點狀，記錄為R，例如12-DG-68在‘IRBLz-Fu’和‘IRBLta-K1’上形成的病斑。與葉片無劃傷接種產生的兩類病斑的癥狀相同，與活體噴霧接種產生病斑的癥狀有所區別。活體噴霧接種產生的非親和性病斑呈褐色點狀，在葉片上均勻分布，親和性病斑呈梭形，病斑中心為灰色，灰色區域外是黃色暈圈，相鄰病斑可成片連在一起(圖1)，這是由活體噴霧接種時的稻瘟菌分生孢子均勻分散在葉片上的特點決定的。

圖1 三種接種方法鑒定稻瘟菌菌株12-DG-68在‘IRBLta-K1’、‘IRBLz-Fu’、‘IRBL9-W’和‘LTH’上的致病型

3種方法獲得的菌株12-DG-68在水稻抗瘟單基因系‘IRBLta-K1’、‘IRBLz-Fu’、‘IRBL9-W’和‘麗江新團黑谷’上致病型分別相同(圖1)，說明了與葉片無劃傷接種和活體噴霧接種相比，葉片劃傷接種方法同樣有效。

2.2 水稻葉片劃傷接種、葉片無劃傷接種和活體噴霧接種效果穩定性比較

為了證明水稻葉片劃傷接種的穩定性，在24個水稻抗瘟單基因系處于4、5和6葉齡期時，我們采用葉片劃傷接種、葉片無劃傷接種和活體噴霧接種分析了菌株12-DG-68在24個水稻抗瘟單基因系上的致病型。檢測了菌株在水稻抗瘟單基因系上3個葉齡期的致病型，結果顯示采用葉片劃傷接種，菌株12-DG-68在24個單基因系上3個葉齡期檢測結果均一致；而采用葉片無劃傷接種，單基因系‘IRBLt-K59’在4葉齡期和6葉齡期時對菌株12-DG-68呈現抗病反應、在5葉齡期時對檢測菌株呈現感病反應，類似的3個葉齡期檢測結果不一致的組合共有3個；采用活體噴霧接種，單基因系‘IRBLk-Ka’在4葉齡期時對菌株12-DG-68呈現抗病反應、在5葉齡期和6葉齡期時對檢測菌株呈現感病反應，類似的3個葉齡期檢測結果不一致的組合共有4個(表1)，說明了水稻葉片劃傷接種在水稻秧苗4～6葉齡期時抗瘟性檢測結果穩定，而葉片無劃傷接種和噴霧接種檢測結果不穩定。另外，采用葉片無劃傷接種，單基因系‘IRBLi-F5’對檢測菌株呈現抗病反應，而其他兩種方法檢測時對檢測菌株呈現感病反應，類似的“假抗性”檢測結果共有3個；采用活體噴霧接種接種，單基因系‘IRBLsh-S’對檢測菌株呈現抗病反應，而其他兩種方法檢測時單基因系IRBLsh-S對檢測菌株呈現感病反應(表1)，說明了與其他兩種接種方法相比，水稻葉片劃傷接種的檢測結果更準確。基于對菌株12-DG-68在水稻抗瘟單基因系上3個葉齡期時的致病型檢測結果比較分析，發現離體水稻葉片劃傷接種具有接種效果穩定和準確的特點。

2.3 水稻葉片劃傷接種與葉片無劃傷接種和活體噴霧接種方法的比較

根據上述接種結果，作者比較了葉片劃傷接種、葉片無劃傷接種和活體噴霧接種等3種方法。相對于葉片無劃傷接種和活體噴霧接種法，葉片劃傷接種法具有幾個方面的優勢(表2)。首先，離體葉片劃傷接種法適用于不同葉齡葉片的接種，而且不同葉齡的葉片反應是一致的，說明其接種結果的穩定性和準確性好。其次，一次種植的稻苗可通過葉片劃傷接種法加以多次利用。此外，對于分生孢子產量很低的稻瘟菌菌株也可利用其菌塊通過葉片劃傷接種法對其致病型加以測定(圖2)。

表1三種接種方法鑒定稻瘟菌菌株12-DG-68在水稻抗瘟單基因系4、5、6葉齡期的致病型1)

Table1Pathotypesof12-DG-68onthe24monogenicricelines,eachwithasingledistinctblastresistancegeneatthe4th,5thand6thleafstages,identifiedbythreeinoculationmethods

單基因系Monogenicline接種方法 Inoculationmethods葉片劃傷接種Woundinoculation4葉期4?leafstage5葉期5?leafstage6葉期6?leafstage葉片無劃傷接種Spotinoculation4葉期4?leafstage5葉期5?leafstage6葉期6?leafstage活體噴霧接種Sprayinginoculation4葉期4?leafstage5葉期5?leafstage6葉期6?leafstageIRBLa?ASSSSSSSSSIRBLi?F5SSSRRRSSSIRBLks?F5SSSSSSSSSIRBLk?KaSSSSSSRSSIRBLkp?K60SSSRRRSSRIRBLkh?K3SSSSSSSSSIRBLz?FuRRRRRRRRRIRBLz5?CASSSSSSSSSIRBLzt?TRRRRRRRRRIRBLta?K1RRRRRRRRRIRBLb?BRRRRRRRRRIRBLt?K59SSSRSRSSSIRBLsh?SSSSSSSRRRIRBL1?CLSSSRRRSSSIRBL3?CP4SSSSSSSSSIRBL5?MRRRRRRRRRIRBL7?MSSSRSSSRRIRBL9?WSSSSSSSSSIRBL12?MRRRRRRRRRIRBL19?ASSSSSSSSSIRBLkm?TsSSSSRRSSRIRBL20?IR24SSSSSSSSSIRBLta2?PiRRRRRRRRRIRBL11?ZhSSSSSSSSS

1) 表中R和S分別表示抗病和感病反應，粗體R表示該抗性反應與另外兩種方法鑒定的反應不一致，粗體斜體R表示該抗性反應與其他葉齡的反應不一致。
R and S indicate resistant and susceptible reactions, respectively.Rin bold indicates that the resistance reactions were inconsistent with reactions identified with the other two methods.Rin bold and italic indicates the resistance reactions were inconsistent with reactions on rice leaves at different stages.

表2離體葉片劃傷接種方法的優勢

Table2Advantagesofthewoundingdetachedriceleafinoculationmethod

接種方法Inoculationmethod秧苗葉齡Seedlingstage檢測結果的可靠性Assayreliability秧苗利用率Seedlingutilizationefficiency對孢子量需求Requirementforconidiumamount葉片劃傷接種4～6葉期準確、穩定多次少或不需要葉片無劃傷接種4葉期有假抗性，有時不穩定多次少活體噴霧接種4葉期有假抗性，有時不穩定一次，感病植株可能死亡多

3 討論

準確穩定的稻瘟菌接種方法是篩選抗稻瘟病材料、鑒定新抗瘟基因和鑒定病菌致病型的基礎，然而目前常用接種方法因檢測結果不穩定而干擾抗源篩選、抗瘟基因鑒定和病菌致病型的鑒定[6]，我們在驗證水稻品種抗瘟性時也發現假抗性現象，即在用一些稻瘟菌株檢測水稻品種(系)的抗性時反應是感病的組合，采用葉片無劃傷接種和活體噴霧接種的檢測結果呈抗病反應，促使我們改進稻瘟菌的傳統接種方法，最終建立了離體葉片劃傷接種方法。

本研究顯示，與已有的葉片無劃傷接種和活體噴霧接種法相比，葉片劃傷接種法對于不同葉齡的葉片接種所獲得的反應是一致的，說明該接種法的鑒定結果是準確的。因此，此接種方法適用于抗病育種中抗性材料的鑒定和抗瘟基因克隆過程后代群體表型的鑒定。離體葉片劃傷接種法能多次利用一次種植的稻苗，可以節省時間和材料，有助于大規模抗源材料的篩選和病菌群體致病型的測定，并可快速獲得鑒定結果。此外，許多田間分離的稻瘟菌菌株分生孢子產量很低，不易進行接種。如果不對這些菌株的致病型測定，很難準確反映稻瘟菌田間群體的致病型變化，從而難以指導抗瘟品種的培育和抗瘟基因型布局。葉片劃傷接種法可利用菌塊進行接種，克服稻瘟菌菌株分生孢子產量低的困難，可以用于稻瘟菌田間群體大規模致病型的測定，因此在抗瘟品種的培育和抗瘟基因型布局中將有重要利用價值。

圖2 用菌絲塊接種劃傷葉片鑒定稻瘟菌對不同水稻品種的致病性

本研究建立的水稻離體葉片劃傷接種法僅適合于主效抗病基因介導的抗瘟性和稻瘟菌致病型的定性測定。目前報道的80余個抗瘟主效基因均對稻瘟菌表現出抗擴展性。水稻離體葉片劃傷接種法在供試水稻葉片上制造了傷口并將稻瘟菌接種在傷口處，使稻瘟菌免去穿透葉片表皮層和表皮細胞壁而直接進入葉內[7]，水稻品種若含與入侵稻瘟菌無毒基因相匹配的抗瘟基因，則啟動主動防衛反應將稻瘟菌遏制在接種位點而表現為抗病，否則稻瘟菌蔓延擴展而表現為感病[8-9]。因此，水稻葉片劃傷接種法對于絕大多數抗瘟主效基因的鑒定是適用的，對于數量抗性，包括病斑數和病斑大小的定量測定是不適用的。同樣，對稻瘟菌的致病力的測定，包括侵入率和侵染菌絲的擴展速度測定也不適用。

[1]雷財林, 張國民, 程治軍, 等. 黑龍江省稻瘟病菌生理小種毒力基因分析與抗病育種策略[J]. 作物學報,2011,37(1):18-27.

[2]Chi M H, Park S Y, Kim S, et al. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host [J]. Plos Pathogen, 2009,5(4):1-16.

[3]Jia Y, Valent B, Lee F N. Determination of host responses toMagnaporthegriseaon detached rice leaves using a spot inoculation method [J]. Plant Disease, 2003,87(2):129-133.

[4]Hiroshi T, Mary J T Y, Ebron L A, et al. Development of monogenic lines of rice for blast resistance [J]. Breeding Science, 2000,50(3):229-234.

[5]Jiang N, Li Z Q, Wu J, et al. Molecular mapping of thePi2/9 allelic genePi2-2 conferring broad-spectrum resistance toMagnaportheoryzaein the rice cultivar Jefferson [J]. Rice,2012,5(1):29-36.

[6]陳德西, 李仕貴, 馬炳田, 等. 水稻抗稻瘟病育種研究進展[J]. 安徽農學通報, 2008,14(17):206-209.

[7]Howard R J, Valent B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogenMagnaporthegrisea[J]. Annual Review of Microbiology, 1996,50:491-512.

[8]Bryan G T, Wu K S, Farrall L, et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance genePita[J]. The Plant Cell, 2000,12(11):2033-2045.

[9]Hamer J E, Talbot N J. Infection-related development in the rice blast fungusMagnaporthegrisea[J]. Current Opinion in Microbiology,1998,1(6):693-697.

IdentificationofMagnaportheoryzaepathotypesbywoundinginoculationofdetachedriceleaves

Zhang Haiwang1, 2, Fang Wenwen1, Liu Cuicui1, Zhao Wensheng1, Peng Youliang1

(1.DepartmentofPlantPathology,ChinaAgriculturalUniversity,TheKeyLaboratoryofPlantPathology,MinistryofAgriculture,Beijing100193,China; 2.InstituteofPlantProtection,LiaoningAcademyofAgriculturalSciences,Shenyang110161,China)

For rice blast resistance breeding and blast resistance gene deployment, it is required to establish an accurate, rapid and large scale inoculation method ofMagnaportheoryzae. Here, we report a wounding inoculation method of detached rice leaves. A key step of the method was to make wounds on rice leaves to avoid interference of host plant penetration resistance, which made use of the characteristics of major blast resistance genes that function against development and expansion of the fungal infection hyphae within host tissue. With the method developed in the present study, the leaf spot inoculation method and the spraying inoculation method, we assayed the reactions of 24 rice monogenic lines to a field isolate ofM.oryzae,12-DG-68, and compared reaction differences between the three methods. The results showed that the wounding inoculation generated consistently identical reactions to the isolate on rice leaves from any of the fourth, the fifth and the sixth stage seedlings. In contrast, there were 12.5% and 4.2% false resistant reactions generated by the leaf spot inoculation method and the spraying inoculation method, respectively. With the two traditional inoculation methods, there were also approximately 7% reactions that were inconsistent between leaves from different stages of rice seedlings. In addition, our wounding inoculation method could use mycelium blocks as inocula, which is useful for identifying the pathotypes ofM.oryzaeisolates that produce a small number of conidia. In summary, our results demonstrated that the wounding detached rice leaf inoculation is an accurate, stable and convenient method for large scale assay of the pathotypes ofM.oryzaeisolates.

rice blast; resistance of variety against blast; resistance identification; pathotype

2013-10-30

：2014-06-25

公益性行業(農業)科研專項(201203014)；國家水稻產業技術體系(CARS-01)

S 432.44

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.022

* 通信作者 E-mail: pengyl@cau.edu.cn