甘肅省18種藥用植物病毒病調查及2種病毒病的鑒定

劉 雯， 晏立英， 文朝慧， 陳秀蓉*

(1.甘肅農業大學草業學院草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅省草業工程實驗室,中-美草地畜牧業可持續發展研究中心, 蘭州 730070; 2. 中國農業科學院油料作物研究所,武漢 430062;3.甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730010)

調查研究

甘肅省18種藥用植物病毒病調查及2種病毒病的鑒定

劉 雯1， 晏立英2， 文朝慧3， 陳秀蓉1*

(1.甘肅農業大學草業學院草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅省草業工程實驗室,中-美草地畜牧業可持續發展研究中心, 蘭州 730070; 2. 中國農業科學院油料作物研究所,武漢 430062;3.甘肅出入境檢驗檢疫局, 蘭州 730010)

2012年6月至2013年9月對甘肅省宕昌縣、漳縣、岷縣、渭源縣、隴西縣、臨洮縣等地區種植的具有疑似病毒病癥狀的半夏等18種藥用植物進行調查及采樣。采用黃瓜花葉病毒(CMV)、苜蓿花葉病毒(AMV)、煙草花葉病毒(TMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯X病毒(PVX)、蕪菁花葉病毒(TuMV)等7種雙抗體夾心免疫酶聯檢測(DAS-ELISA)試劑盒初檢,并對CMV和ToMV采用反轉錄PCR(RT-PCR)方法復檢,結果表明,半夏、掌葉大黃和紅花3種藥用植物受到黃瓜花葉病毒(CMV)侵染；馬兜鈴、土貝母及當歸3種植物受到番茄花葉病毒(ToMV)侵染；樣品中未檢測到上述其他病毒種類,其余12種病毒樣品的病原尚未確定。本研究為國內首次報道CMV病毒侵染掌葉大黃、紅花,ToMV病毒侵染馬兜鈴、當歸和土貝母。此研究為防治上述病毒病提供了依據。

藥用植物; 病毒病; DAS-ELISA; RT-PCR

甘肅省是全國重要的藥材生產大省之一,2009年中藥材種植面積達到全國的三分之一[1]。甘肅省中藥材種植分布廣、種類多、產量大,豐富了甘肅的農業結構,是農業生產經濟收入的又一來源,在許多地區已成為當地的支柱產業[2]。但隨著種植面積的擴大,病害連年發生,日趨嚴重。甘肅省關于中藥材病害的研究,主要集中在真菌病害上,中藥材病毒病鮮見報道。目前國內文獻報道了侵染半夏、當歸及地黃3種植物的病毒種類,侵染半夏的病毒有芋花葉病毒(Dasheenmosaicvirus, DMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)和大豆花葉病毒(Soybeanmosaicvirus, SMV)[3-4]；侵染當歸的病毒有馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)[5]；侵染地黃的病毒有煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、地黃退化病毒(Dihuangdegenerationvirus, DDV)、蠶豆萎蔫病毒(Broadbeanwiltvirus, BBWV)[6-7]等。

關于植物病毒病毒源的檢測鑒定,目前主要有生物學方法、電鏡法、血清學方法和分子生物學方法。其中血清學方法具有特異性好、操作簡便、檢測周期短的特點,但在準確性和靈敏度方面還有一定的缺陷；分子生物學方法具有特異性強、靈敏度高的特點,能夠彌補血清學方法的缺點[8]。國內外文獻關于植物病毒的檢測主要采用血清學和分子生物學技術相結合的辦法,其中雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay, DAS-ELISA)和反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)是使用最多的方法[9-10]。

本研究對甘肅省宕昌縣、漳縣、岷縣、隴西縣、渭源縣和臨洮縣6縣種植的黨參、栝樓、紅花及藿香等18種藥用植物上疑似病毒病癥狀樣品進行了調查和采樣,并通過DAS-ELISA及RT-PCR進行檢測鑒定,確定其病毒種類,旨在為甘肅省藥用植物病毒病的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集時間及地點

2012年7月至2013年9月對甘肅宕昌縣阿塢鄉、哈達鋪鎮、官鵝溝藥材園,漳縣大草灘,岷縣麻子川,渭源縣會川鎮,隴西首陽藥材示范園,臨洮縣玉井鎮、南河鄉等地的疑似病毒病癥狀的半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit]、土貝母(Cyanotisvaga(Lour.)Roem.)、當歸[Angelicasinensis(Oliv.)Diels]、黨參[Codonopsispilosula(Franch)Nannf.]、地黃[Rehmanniaglutinosa(Gaert.)Libosch.exFisch.etMey.]、栝樓(Trichosanthessp.)、紅花(CarthamustinctoriusLinn.)、藿香[Agastacherugosa(Fisch.etMey.)O.Kuntze]、馬兜鈴(AristolochiadebilisSieb.etZucc)、射干[Belamcandachinensis(Linn.)DC.]、玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)、天仙子(HyoscyamusnigerLinn.)、刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.etMaxim.)Harms]、芍藥(PaeonialactifloraPall.)、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、款冬花(TussilagofarfaraLinn.)、山藥(DioscoreaoppositaThunb.)、掌葉大黃(RheumpalmatumLinn.)共18種藥用植物進行采集、癥狀描述并拍照,采集的樣品置于-80 ℃冰箱保存備用,通過檢測確定這些植物是否含有病毒,并確定病毒的種類。

1.1.2 試劑

DAS-ELISA檢測試劑盒及陽性對照購自美國Agdia公司,檢測的病毒種類包括黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、苜蓿花葉病毒(Alfalfamosaicvirus, AMV)、煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus, TMV)、番茄花葉病毒(Tomatomosaicvirus, ToMV)、馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY, PVY)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX, PVX)和蕪菁花葉病毒(Turnipmosaicvirus, TuMV)等7種。

植物總RNA 提取試劑盒購自天根公司；One step RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司,其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

分別稱取不同癥狀的藥用植物的葉片3.0 g,加入3倍體積的PBST緩沖液,充分研磨后裝入離心管中,然后3 000 r/min離心5 min,上清液用于DAS-ELISA檢測,另取300 μL上清液按照RNA提取試劑盒說明提取植物總RNA。

1.2.2 血清學檢測

采用DAS-ELISA方法,按照試劑盒說明書,對植物提取液進行檢測,每個樣品設計兩孔重復,并設計陰性和陽性對照,每孔加入100 μL待測樣品,顯色后用芬蘭雷柏酶標儀在405 nm波長下測吸光值。當樣品吸光值與陰性對照吸光值的比值≥2時,判定結果為陽性。

1.2.3 RT-PCR檢測

1.2.3.1引物設計

參照已發表的文獻中[11-12]報道的CMV、ToMV CP基因的特異引物序列合成引物CMVF:5′-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3′,CMVR:5′-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3′;ToMVF:5′-CGGAAGGCCTAAACCAAAAAG-3′,ToMVR:5′-ATTAAGGGAAAAVCACT-3′用于檢測CMV、ToMV的CP基因片段。

1.2.3.2RT-PCR擴增

以植物總RNA為模板按照TaKaRa One Step RT-PCR 反應試劑盒說明書配制25 μL反應體系：2×Step Buffer 12.5 μL,Enzyme Mix 1 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL, RNase Free H2O 8 μL,植物總RNA模板1.5 μL。CMV RT-PCR擴增反應條件：50 ℃反轉錄30 min; 94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s, 55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存；ToMV RT-PCR擴增反應條件：50 ℃反轉錄30 min; 94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s, 54 ℃退火45 s;72 ℃延伸1 min,共35個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。反應結束后取10 μL用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產物,含有目的條帶的RT-PCR產物送金唯智生物公司測序。

1.2.3.3序列比對和系統發育樹的構建

將獲得的CMV和ToMV序列與NCBI上同源序列進行BALST比對后,下載同源序列,用Clustal(Version 1.81)進行多重序列匹配排列(multiple alignments)分析,形成一個多序列匹配排列陣,然后用Mega(Version 5.0) 通過鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹[7-8]。

2 結果與分析

2.1 藥用植物病毒病的癥狀

對采集的18種藥用植物的疑似病毒病樣品進行檢測,其中有6種植物檢測到病毒,其相應癥狀及發生危害情況描述如下。

半夏病毒病：發病初期葉脈顏色正常,葉肉組織變為黃色,褪綠不均勻,主要表現綠斑駁花葉,葉片邊緣向上卷曲；有些葉片葉緣出現鋸齒狀；有些葉片基部皺縮、畸形及全株矮縮、死亡；有些產生黃色條斑及明脈,見圖1a～b。此病發生危害重,在各地種植區普遍發生,許多田塊幾乎全田發病,是目前半夏生產中危害最重的病害。

土貝母病毒病：發病初期在葉片上出現隱約可見的輕微花葉,葉脈透明,出現明脈,后期葉片綠色出現明顯可見的皰斑花葉；有些葉片有黃色環斑,見圖1c。此病在調查的土貝母田均有發生,危害較重,是土貝母的主要病害之一。

圖1 幾種中草藥病毒病的癥狀

當歸病毒病：發病初期,僅上部葉片出現隱約可見的輕微花葉,逐漸出現黃綠不規則的皰斑花葉,葉片略變硬變脆；有少數葉片表現蕨葉,見圖1d。此病在調查區域均有發生,但危害較輕。

紅花病毒病：發病后幼葉皺縮明顯,葉片仍為綠色,老葉出現黃化,逐漸由葉尖向葉基部黃化,老葉皺縮不明顯,見圖1e。此病在紅花田發生較輕。

掌葉大黃病毒病：在葉片上出現明脈,幼葉皺縮明顯,出現黃綠不均勻的花葉,老葉葉肉組織濃綠,但在靠葉脈處有輕微褪綠現象,后發展為皰斑花葉。有少數葉片上有環斑。發病嚴重時,葉片畸形,見圖1f～g。在掌葉大黃上發生較輕。

馬兜鈴病毒病：病株葉片一般稍小,葉片感病后有些出現葉肉組織黃化、淺綠和深綠不規則的花葉；有些葉片出現黃綠皰斑和明脈見圖1h～j。是馬兜鈴上的常見病害,但危害較輕。

2.2 血清學測試結果

DAS-ELISA檢測結果表明,18種中藥材植物中紅花樣品的CMV檢測值與陰性對照的比值大于2,呈現陽性；馬兜鈴、當歸及土貝母的ToMV檢測值與陰性對照的比值大于2,呈陽性(表1)。18種中草藥的TuMV、AMV、PVY、PVX、TMV的檢測值與陰性值比均小于2,檢測結果為陰性。初步確定紅花攜帶有CMV病毒,馬兜鈴、當歸、土貝母攜帶有ToMV病毒。

2.3 RT-PCR檢測結果

2.3.1 電泳檢測結果

根據上述檢測結果,進一步采用RT-PCR檢測18種藥用植物中是否含有CMV和ToMV。電泳檢測結果可看出,半夏、掌葉大黃和紅花3種植物在776 bp處出現了與CMV陽性對照大小一致的條帶,檢測結果呈陽性(圖2a)；馬兜鈴、土貝母及當歸均在686 bp處出現了與ToMV陽性對照大小一致的條帶,檢測結果為陽性(圖2b)；其他中草藥均未檢測出任何條帶。

表1中草藥CMV及ToMV的DAS-ELISA檢測結果

Table1DAS-ELISAdetectionofCMVandToMVonmedicalherbs

樣品SampleCMV檢測值A405A405反應類型ReactiontypeToMV檢測值A405A405反應類型Reactiontype陽性對照Positivecontrol0．210+0．958+陰性對照Negativecontrol0．087-0．081-半夏Pinelliaternata0．102-0．076-掌葉大黃Rheumpalmatum0．085-0．076-紅花Carthamustinctorius1．639+0．096-馬兜鈴Aristolochiadebilis0．090-0．218+當歸Angelicasinensis0．106-0．182+土貝母Cyanotisvaga0．100-0．182+

1) +: 陽性反應; -: 陰性反應 +: Positive; -: Negative

圖2 幾種中草藥的RT-PCR檢測

2.3.2 序列分析及系統發育樹構建

ELISA和RT-PCR檢測結果表明半夏、掌葉大黃、紅花攜帶有CMV病毒,馬兜鈴、土貝母、當歸攜帶有ToMV病毒,選取具有代表性的植物紅花、馬兜鈴進一步測序和BLAST分析,結果表明,紅花上CMV(CMV-HH-1分離物)序列(登錄號JX878884.1)與已報道的CMV序列(登錄號Z12818.1,tobacco,M21464.1,cucumber,U22822.1)同源性達98%,選取NCBI登陸的CMV CP基因氨基酸序列,進一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通過鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹。從進化樹構建結果(圖3)可以看出,CMV-HH-1是CMV亞族Ⅱ株系。從分子水平上進一步確定半夏、掌葉大黃及紅花植物上攜帶有CMV病毒。馬兜鈴上ToMV長度為686 bp,經BLAST分析,與已報道的ToMV序列(登錄號DQ873692.1,tomato,AB355139.1,tobacco,AJ429085.1,Lycopersiconperuvianum)同源性達98%,選取NCBI登錄的ToMV煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)、煙草輕綠花葉病毒(Tobaccomildgreenmosaicvirus,TMGMV)CP基因氨基酸序列,進一步用Clustal(Version 1.81)和Mega(Version 5.0)通過鄰接法構建系統發育樹。從進化樹構建結果(圖4)可以看出,該病毒(MDL分離物)是ToMV株系。從分子水平上進一步確定,馬兜鈴上攜帶有ToMV病毒。

圖3 紅花CMV-HH-1分離物與部分CMV分離物CP基因氨基酸序列同源性分析

3 討論

通過DAS-ELISA方法檢測到紅花含有CMV病毒,馬兜鈴、當歸、土貝母含有ToMV,與RT-PCR方法檢測結果一致；用DAS-ELISA方法對半夏、掌葉大黃樣品進行CMV病毒檢測的結果為陰性,但通過RT-PCR方法在該樣品中檢測到CMV,可能是由于半夏、掌葉大黃樣品中病毒含量較低,受DAS-ELISA靈敏度限制所致。這與郭巧萍[13]報道的DAS-ELISA方法靈敏度不夠高,不能完全檢測出半夏上的CMV病毒的結果相一致。相比之下,RT-PCR方法的檢測靈敏度更高、特異性更強[14-15],本研究利用RT-PCR在核酸水平上證明了病毒的存在。

圖4 馬兜鈴MDL分離物與部分ToMV分離物CP基因氨基酸序列同源性分析

利用已購買的7種病毒檢測試劑盒對18種中草藥進行檢測,初步檢測到6種藥用植物上攜帶的病毒,剩下12種未檢測到病毒,還需要后期繼續其他種類病毒的檢測鑒定。本研究中掌葉大黃、紅花上檢測到CMV病毒,馬兜鈴、當歸、土貝母上檢測到ToMV病毒尚屬國內首次報道。其中當歸受ToMV侵染后主要表現出花葉和蕨葉的癥狀，除張玉[2]報道的當歸受PVY侵染后葉片呈現斑點的癥狀以外，未見其他關于當歸病毒病及癥狀的報道。建議后期工作對上述幾種植物中的病毒進行電鏡觀察、生物學接種等深入系統的研究。

本研究初步檢測出甘肅地區中草藥病毒病的病毒種類主要有CMV和ToMV。CMV、ToMV為常見植物病毒,發生普遍、寄主范圍廣,經濟危害嚴重；其中CMV能侵染85科1 000多種單、雙子葉植物,能夠通過種子、繁殖材料和蚜蟲傳播[16]；ToMV能侵染茄科、十字花科等許多科植物,能夠通過種子、機械損傷和蚜蟲傳播[17]。其他5種病毒未檢測到,其原因是由于未被這5種病毒侵染,還是由于采集的標本數量有限,有待進一步研究。由于甘肅省藥用植物種植面積大,種植地區比較固定,種植時間久,繁殖方法多以無性繁殖為主,致使病毒病的發生較重,如果不及時進行控制,病毒病會逐年加重造成嚴重損失[1]。繁殖無毒種苗、加強田間管理、使用防蟲網防止蚜蟲等害蟲、不與其他作物混種等措施可有效防止病毒病的發生。本研究初步對甘肅地區中草藥病毒病的種類進行了確定,對病害防治和脫毒苗生產提供了重要依據。

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Surveyofvirusdiseaseson18speciesofmedicalherbsinGansuProvinceandidentificationoftwovirusdisease

Liu Wen1, Yan Liying2, Wen Zhaohui3, Chen Xiurong1

(1.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince,Sino-U.S.CenterforGrazinglandEcosystemSustainability,PrataculturalCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China;2.OilCropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan430062,China;3.GansuExit-EntryInspectionandQuarantineBureau,Lanzhou730010,China)

Eighteen species of medical herbs showing virus-like symptoms were surveyed for the occurrence of viruses in Gansu Province.Cucumbermosaicvirus(CMV),Alfalfamosaicvirus(AMV),Tobaccomosaicvirus(TMV),Tomatomosaicvirus(ToMV),PotatovirusY (PVY),PotatovirusX (PVX), andTurnipmosaicvirus(TuMV) were detected in leaf samples by DAS-ELISA. The ELISA results showed that CMV was onPinelliaternata,RheumpalmatumandCarthamustinctoriusand ToMV was onAristolochiadebilis,BolbostemmapaniculatumandAngelicasinensis. Their presence was confirmed by RT-PCR with amplification of 776 bp and 686 bp fragments of the coat protein genes, respectively. Sequence analysis of viral amplicons demonstrated Gansu isolates had high (98%) nucleotide sequence identities with other CMV and ToMV strains. It is the first report of CMV infectingR.palmatumandC.tinctoriusand ToMV infectingA.debilis,B.paniculatum, andA.sinensisin China.

medical herbs; plant virus disease; DAS-ELISA; RT-PCR

2013-10-31

：2014-02-12

甘肅省中藥材產業科技攻關項目(GYC11-01)；國家質檢總局科技計劃項目(2012IK270);甘肅出入境檢驗檢疫局科技計劃項目(2011GK001)

S 435.67

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.05.025

* 通信作者 E-mail: chenxiurong@gsau.edu.cn