橡膠樹多倍體誘導機制和途徑

張源源　康向陽　李維國

摘 要 多倍體育種作為橡膠樹育種的重要手段，曾引起育種工作者的廣泛關注并進行了大量研究。本文從獲得橡膠樹多倍體的機制和途徑方面總結前人的研究成果；討論橡膠樹多倍體育種面臨的問題；提出橡膠樹多倍體育種的研究方向，為橡膠樹多倍體育種工作提供理論幫助。

關鍵詞 橡膠樹 ；多倍體 ；機制 ；途徑

分類號 S335.1

橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）在植物分類學上屬于大戟科（Euphorbiaceae）橡膠樹屬（Hevea），被認為是一種雙二倍體（2n=4x=36）植物[1]。橡膠樹的次生代謝物質橡膠是制造輪胎等制品的重要原料，通過選育橡膠樹新品種提高橡膠產量的重要性不言而喻。然而，當前橡膠樹育種由于種種原因[2-3]而出現了停滯不前的局面。在云南廣泛種植的橡膠樹優良品種云研77-2和77-4被證明為三倍體[4]，表明多倍體橡膠樹品種具有大幅度提高產量和抗性的潛力，為打破橡膠樹育種的困境提供了一種新的思路。

多倍體育種作為林木育種的一種重要理論和方法，自20世紀70年代在橡膠樹育種中有過短暫熱潮后，一直處于低谷。本文通過討論獲得橡膠樹多倍體的機制和途徑，總結前人在橡膠樹多倍體育種方面的研究成果，探討橡膠樹多倍體育種面臨的問題和解決途徑，希望能夠引起橡膠樹育種工作者對多倍體育種這一領域的重新關注，開辟橡膠樹多倍體育種的新天地。

1 植物多倍體的特點

多倍體是指具有三套或三套以上完整染色體組的生物個體。多倍體植物存在廣泛。據估計，大約30%～80%植物種中存在多倍體[5]。多倍體化在基因表達和發育過程中具有重要影響，可直接改變物種的形態、繁殖系統和生態適應性，是形成新物種的重要途徑之一，是推動進化的重要力量[6]。

多倍體植物具有細胞體積大、個體高大、葉片寬厚、分枝數少、花果少、種子大、生長速度快、代謝速率高、次生代謝物質產量高、抗逆性和適應性強等特點[7-10]。在以獲得生物產量為目標的生產應用中具有二倍體無可比擬的優勢。多倍體育種具有產生雜種優勢、獲得基因冗余、打破自交不親和壁壘、改變生殖系統的優點，是植物遺傳育種的重要手段之一[11]。

多倍體有諸多的優點，但是多倍化導致的細胞結構改變、有絲分裂和減數分裂不穩定、易產生非整倍體、育性降低、改變基因表達調控、表觀遺傳不穩定等[11]，同樣會影響到多倍體的利用。

2 植物產生多倍體的機制

開花植物產生多倍體的機制主要有體細胞染色體加倍和未減數配子（2n）發生2種[12-14]，這些機制同樣適用于橡膠樹。

2.1 體細胞染色體加倍

體細胞染色體加倍是在體細胞進行有絲分裂的過程中，通過物理（機械損傷、高低溫、射線等）或化學（秋水仙堿、紫杉醇等）刺激，抑制紡錘絲活動，阻止染色體分向兩極，從而獲得染色體加倍的細胞或組織。植物孢子體的分生組織由于各種刺激常會產生染色體加倍的細胞，常發生于生長點、傷口或腫瘤部位，是新多倍體芽的來源。體細胞染色體加倍獲得的均是偶數倍的多倍體，但是因為不是所有的組織或細胞均會產生加倍作用，因而常形成混倍體。體細胞染色體加倍還發生于合子細胞或者幼胚組織，形成整倍體。

2.2 未減數配子

未減數配子（2n）融合獲得多倍體被認為是形成多倍體的最主要的途徑[15]。2n配子主要通過大、小孢子發生時的“不減數”或者“減數分裂重組”產生。2n配子的產生機制主要有[16-17]：（1）孢原細胞有絲分裂失敗，如發生內有絲分裂或雙二倍化等；（2）染色體聯會異常；（3）減數分裂缺失；（4）胞質提前分離；（5）胞質分離失敗；（6）第二次減數分裂時形成平行染色體；（7）胞質分離異常形成多微核后融合等。所有機制按照其遺傳效應可以分為第一次減數分裂復原（FDR，first division restitution）、第二次減數分裂復原（SDR，second division restitution）2種，分別可以遺傳親本約70%～80%、30%～40%的雜合性[18]。

3 獲得橡膠樹多倍體的途徑

橡膠樹作為世界范圍內的重要經濟樹種，國外在20世紀40年代就開始了多倍體誘導研究[19]，國內在20世紀70年代也隨之開始了相關研究。通過幾十年的研究，已經可以通過不同途徑獲得多倍體植株。總結起來，可以分為自然選擇和人工誘導兩大途徑。

3.1 直接選擇和分離多倍體

直接從自然界選擇和分離多倍體是獲得多倍體植株最便捷的方法。目前，已經從自然界直接分離出了歐洲山楊[20]、桑樹[21]、漆樹[22]等三倍體植株，有的還應用到了生產中。

天然多倍體橡膠樹同樣存在，通過形態篩選和細胞學鑒定以及流式細胞檢測等手段，是獲得橡膠樹多倍體的重要手段之一。胡東瓊等[23]從橡膠樹GT1的人工授粉苗、無性系種子實生苗和種子園實生苗中首次分離出了三倍體植株。緊接著，劉陽平[24]報道稱于1970年發現了一株天然三倍體橡膠樹。此后，鮮有天然多倍體橡膠樹發現的報道。直到2009年，敖碩昌等[25]利用GT1×PR107自然雜交后代選育出的云研77-2和云研77-4被證實為多倍體，成為首例大面積應用于生產的橡膠樹天然多倍體[4]。張源源[26]從橡膠樹GT1的自然授粉種子中檢測出3株天然三倍體，首次分析天然三倍體檢出率為0.72%。

3.2 人工誘導獲得多倍體

人工誘導獲得多倍體是指通過物理方法（輻射、機械刺激、高低溫等）和化學方法（秋水仙堿、紫杉醇、N2O[27]等）誘導體細胞染色體加倍或者生殖細胞不減數分裂，從而獲得多倍體。人工誘導的對象多種多樣，根據處理材料可以分為活體細胞、離體細胞和生殖細胞誘導等。此外，通過原生質體融合和胚乳培養同樣可以獲得多倍體。endprint

3.2.1 活體誘導

活體誘導主要是通過輻射、秋水仙堿等處理種子、生長點等，然后經過多代分離和芽接獲得較為純合的多倍體植株。這種途徑方法簡單，技術要求低，處理批量大，可直接從優良植株上獲得多倍體。

橡膠樹中主要通過種子、幼苗、頂芽誘導獲得多倍體植株。國外研究方面，Luiz等[28]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹實生苗，獲得了四倍體植株。馬來西亞橡膠研究院（RRIM）普蘭沙伯研究站于20世紀60年代用秋水仙堿處理橡膠樹實生苗，獲得了多倍體植株[29]。70年代，巴西農業研究所通過秋水仙堿處理誘導出了IAN870的多倍體植株[30]。印度橡膠研究所用秋水仙堿處理從GT1芽條的一個芽和無性系Tjir1的種子誘導出了多倍體植株[1，31-33]。

在國內，陸永林[34]從1974年開始用秋水仙堿溶液處理發芽的種子、種子幼芽和無性系頂芽，獲得了一批多倍體植株。鄭學勤等[35-36]于1980年首次報道用細胞學方法鑒定出了橡膠樹多倍體植株。劉陽平[24]用不同濃度秋水仙堿溶液處理實生苗和無性系苗，獲得了倍性穩定的多倍體植株。凌緒柏等[37]用秋水仙堿溶液處理無性系萌動芽，獲得了穩定的多倍體。張樹珍等[38]用濃度為1%的秋水仙堿溶液處理橡膠樹無性系芽，誘導分理出了多倍體細胞達85%以上的多倍體無性系。從種子、幼苗和頂芽獲得的多倍體大多是混倍體或嵌合體，經過多代分離后仍然難以獲得完全純合的多倍體，倍性優勢難以發揮。因此，目前尚沒有通過人工誘導得到的多倍體應用于生產的例子[39]。

3.2.2 離體誘導

離體誘導是相對于活體誘導的又一種體細胞誘導獲得多倍體的方法。離體誘導可以直接獲得純合四倍體或者更高倍性體，克服了活體誘導產生混倍體的缺點，同時試驗條件易于控制，結果重復性高，對于已經建立組織培養體系的植物，能夠在短時間內誘導出大量多倍體植株。當前，橡膠樹的組織培養技術尚不成熟，影響多倍體誘導的成功率，因而研究成果較少，只有曾憲松等[40]用0.5%的秋水仙堿處理二倍體植株的花藥體細胞愈傷組織，誘導出了4株純合四倍體植株。

3.2.3 未減數配子

未減數配子融合獲得多倍體是形成多倍體的主要途徑[15]。活體或離體細胞誘導獲得主要是同源四倍體，而未減數配子雜交途徑獲得的是異源多倍體，同時具有倍性效應和雜合效應，具有更大的育種價值。

橡膠樹育種工作者在人工誘導未減數配子方面做了初步的研究和嘗試，獲得了少量三倍體植株。鄭學勤等[34]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹單核期雄花，然后采集成熟花粉用于授粉，獲得了純合三倍體。賴杭桂等[41-42]用秋水仙堿溶液處理橡膠樹性器官，分別獲得了未減數大小孢子，分別同二倍體植株授粉，初步認定獲得了2株三倍體植株。其后，通過流式細胞儀檢測確認獲得的疑似植株為三倍體，并通過分子標記方法鑒定出了父母本[43]。

3.2.4 原生質體融合和胚乳培養

原生質體融合和胚乳培養是獲得植物多倍體的兩個重要途徑。原生質體融合又稱體細胞雜交，該技術的發展是建立在原生質體培養和組織培養的基礎上的。首先，用纖維素酶和果膠酶處理植物細胞，得到無壁的原生質體，再通過化學或物理方法誘導異核體，進一步融合后成為共核體，經培養后誘導分化出同源或異源多倍體植株[44]。目前，通過原生質體培養已經得到橡膠樹的愈傷組織[45]，獲得再生植株[46-47]，為進行橡膠樹原生質體融合獲得多倍體打下了基礎。

胚乳是由3個單倍體核融合而成的，1個單倍體核來自雄配子體，2個來自雌配子體，因此胚乳是天然的三倍體組織，具有雙親的遺傳成分，對育種后代性狀有一定的預見性。橡膠樹種子具有豐富的胚乳，通過胚乳培養獲得橡膠樹三倍體植株是極有可能實現的[48]。目前尚沒有進行橡膠樹胚乳培養的相關研究。

3.2.5 倍性間雜交

在獲得天然多倍體或者人工誘導多倍體后，通過不同倍性個體間雜交，可直接得到不同倍性的后代。例如四倍體同二倍體雜交獲得三倍體，三倍體（極少數的）同二倍體雜交獲得四倍體或三倍體，更高倍性間雜交獲得更多倍性的后代。

人工誘導（主要是體細胞誘導）獲得的多倍體橡膠樹大多倍性不穩定，在生長過程中多倍性逐漸消失[49]。此外，橡膠樹生長周期長，開花結實需要較長時間，在進行雜交時需要親本具有較強的配合力，種種因素限制了橡膠樹的倍性間雜交的研究。只有印度于1980年報道，用秋水仙堿誘導獲得的四倍體植株同常規二倍體植株雜交，育成若干三倍體植株[19]。

4 橡膠樹多倍體育種現狀和前景展望

橡膠樹多倍體育種自20世紀40年代開始以來，進行了大量的研究工作，在多倍體誘導技術方面取得了重要的研究進展。這些研究主要集中在體細胞染色體加倍方面，目前已經可以通過誘導枝條變異，然后截頂分離并且經過形態學、細胞學鑒定快速獲得多倍體植株。盡管通過不同途徑獲得了大量多倍體植株，但是只有從自然授粉后代中直接選擇出的三倍體云研77-2和云研77-4得到大面積生產應用。人工誘導橡膠樹體細胞染色體加倍獲得多倍體的研究工作最多，卻至今沒有成功應用于生產的報道，其原因可能是多倍體中基因雜合效應較倍性效應更為重要[50]，體細胞染色體加倍得到的多倍體在獲得基因劑量效應的同時，減弱了基因雜合效應。

通過未減數配子雜交獲得的多倍體可以獲得基因劑量效應的同時不減弱基因雜合效應，是橡膠樹多倍體育種最為行之有效的途徑，但是此方面的研究較少。在進行人工誘導配子染色體加倍時，掌握樹種的相關細胞遺傳學知識可以取得事半功倍的效果[8]。橡膠樹的大、小孢子發育過程等相關細胞學基礎知識匱乏，影響了橡膠樹未減數配子雜交進行多倍體育種研究的效果。另外，盡管獲得大量橡膠樹多倍體植株，卻鮮有對其進行篩選和生產鑒定的后續報道。橡膠樹在加倍后，由于基因重組、染色體重排，以及基因表達、表觀遺傳等變化的影響，不是所有多倍體的表現都優于二倍體，需要進一步進行選擇和鑒定。后期需要的大量時間、人力物力投入，影響了橡膠樹多倍體育種的發展。endprint

綜上所述，人工誘導未減數配子應該是未來橡膠樹多倍體育種研究的一條有效途徑。立足于橡膠樹生殖生物學研究[51-60]，突破人工誘導未減數配子的有效方法和處理時期等關鍵技術，在獲得大量基因型不同的多倍體植株的基礎上，根據“大群體、強選擇”的育種策略，從中選擇表現優良的多倍體植株進行無性系鑒定，從而選育出符合當前和未來橡膠樹生產需要的新品種，豐富橡膠樹種質資源，為我國橡膠生產提供品種支撐。

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