MicroRNA-16對類風濕關節炎患者滑膜成纖維細胞增殖、侵襲及細胞因子分泌的影響

史棟梁， 史桂榮

(1河南省中醫院風濕骨病科，河南 鄭州 450002； 2商丘醫學高等專科學校，河南 商丘 476100)

類風濕關節炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種全身性的自身免疫疾病，以慢性、對稱性多關節炎為主要臨床表現。它的發病機制復雜，已有多種細胞、細胞因子和蛋白酶類參與[1]。滑膜成纖維細胞(synovialfibroblasts，SFs)的活化及致炎因子的分泌是導致RA炎癥和組織破壞的直接機制[2]。MicroRNAs(miRNAs)是一類新型保守的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于各種生物體中。多項研究表明，miRNA與RA的發生、發展密切相關[3-4]。miR-16是miRNAs家族的重要成員，近期研究證實，RA患者中miR-16的表達水平明顯增高，提示miR-16可能在RA的病理進程中發揮重要作用[5]。因此，本研究以RASFs為對象，構建miR-16過表達和低表達的RASFs模型，分析miR-16對RASFs增殖、侵襲及胞外基質、炎癥因子水平的影響，為RA的防治提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料、試劑和儀器

人關節滑膜組織取自河南省中醫學院二附院關節外科行關節置換術的RA患者，患者均簽署知情同意書，RA患者臨床診斷均符合美國風濕病學會標準。

RNAiso Plus kit、PrimeScript? RT reagent kit、SYBR?PremixExTaqTMII kit、LipofectamineTMRNAiMAX、抗β-肌動蛋白抗體、抗基質金屬蛋白酶3/13(matrix metalloproteinase 3/13，MMP3/13)抗體、抗IL-1β抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(Invitrogen)；iQ5實時定量PCR儀和激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad)；miR-16 mimic和miR-16 抑制劑(Thermo Scientific)；ECL化學發光試劑盒、MTT、DMSO、DMEM培養基、annexin V-FITC和PI(Sigma)；CO2細胞培養箱(Binder)；流式細胞儀(Olympus)。

2 方法

2.1RASFs的培養 術中取出滑膜組織，立即于無菌條件下剪碎，2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化2 h后，離心收集細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養。當細胞長至接近融合狀態后即可傳代，第3～8代用于實驗。

2.2細胞的分組及轉染 實驗分為4組：空白對照組(control)、脂質體對照組(mock)、miR-16抑制劑組及miR-16mimic組。采用LipofectamineTM2000將miR-16mimic或miR-16抑制劑轉染細胞，混勻后于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中孵育。

2.3RT-PCR 收集細胞，按試劑盒說明書提取總RNA。反轉錄合成第1鏈cDNA，PCR擴增。miR-16上游引物5’-TGC GGT AGC AGC ACG TAA AT-3’，下游引物5’-TGC AGG GTC CGA GGT AT-3’；MMP3上游引物5’-GGG TGA GGA CAC CAG CAT GA-3’，下游引物5’-CAG AGT GTC GGA GTC CAG CTT C-3’；MMP13上游引物5’-TTG AGG ATA CAG GCA AGA CT-3’，下游引物5’-TGG AAG TAT TAC CCC AAA TG-3’；IL-1β上游引物5’-ATC TCC TGC CAA CCC TAC A-3’，下游引物5’-CTT TCA GCT CAT ACG TGC C-3’；β-actin上游引物5’-GGT GTG ATG GTG GGT ATG GGT-3’，下游引物5’-CTG GGT CAT CTT TTC ACG GT-3’)。按照試劑盒的說明書進行RT-PCR。擴增條件為：預變性94 ℃ 5 min，進入循環，94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個循環后，72 ℃ 5 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用Primer 5.0軟件設計引物。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。依據2-ΔΔCt法計算各樣本mRNA的相對表達量。

2.4MTT法測定RASFs增殖 取對數期生長的RASFs接種于96孔板，每孔200μL，含2×104個細胞，加入miR-16mimic或miR-16抑制劑混勻后培養48h，設置空白對照組；每孔加入20μLMTT溶液(5g/L)，繼續培養4h；棄上清，加入150μL二甲基亞砜，搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解；酶標儀上測定570nm處A值。

2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 取對數生長期的轉染細胞和對照細胞，胰酶消化后，用無血清培養基洗3次，將細胞懸液密度調整成2×108/L。預先將Matrigel用無血清培養基DMEM稀釋成1∶3濃度，均勻地鋪滿Transwell小室上室的聚碳酸酯膜，室溫放置1 h。在下部小室中加入500 μL含10% FCS的DMEM培養基，小室內接種200 μL無血清細胞懸液，培養16 h 后取出Transwell膜，用PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色10 min，顯微鏡下拍照，統計穿過Transwell膜的細胞數。

2.6AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡 按操作說明書進行凋亡實驗，具體操作為：收集各組細胞，用預冷的PBS洗滌3次，加入1mL1×annexinV結合緩沖液，離心去上清，在加入200μL結合緩沖液重懸細胞，分別加入10μLannexinV-FITC和5μLPI(5mg/L)，輕輕混勻，避光孵育30min，流式細胞術檢測。

2.7Western blotting 將培養的細胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌3次；加入450 μL細胞裂解液裂解細胞，SDS-PAGE蛋白電泳；電泳結束后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h后加稀釋好的Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發光，X光片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。以β-actin作為內參照。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 11.0統計軟件處理，多組樣本間兩兩比較用單因素方差分析(ANOVA)及LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 轉染效率的測定

Mock組RASFs中miR-16表達水平較對照組無明顯變化，而miR-16 mimic和miR-16抑制劑組RASFs中miR-16的表達水平分別為2.49±0.19和0.21±0.05，與對照組相比差異顯著(P<0.05),見圖1。

Figure 1. The expression of miR-16 in RASFs determined by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

2 miR-16對RASFs增殖和侵襲的影響

如圖2A所示，與對照組相比，mock組無顯著變化；而miR-16 mimic組可以抑制RASFs的增殖，其A值為0.31±0.07，miR-16抑制劑組則可促進RASFs的增殖，其A值為1.39±0.19，均有顯著差異(P<0.05)。細胞侵襲結果如圖2B所示，與對照組相比，mock組無顯著變化；而miR-16 mimic組可以抑制RASFs的侵襲，穿膜細胞數為47±5(P<0.05)，miR-16抑制劑組則可促進RASFs的侵襲，穿膜細胞數為149±13，均顯著差異(P<0.05)。

3 miR-16對RASFs凋亡的影響

流式細胞術分析顯示左下區細胞簇為活細胞，左上區細胞簇為壞死細胞，右下區及右上區細胞簇分別為早期凋亡和晚期凋亡細胞。與對照組相比，mock組、miR-16 mimic及miR-16抑制劑組的總細胞凋亡率均無顯著差異(P>0.05),見圖3。

4 miR-16對RASFs中MMPs表達水平的影響

將miR-16 過表達轉染RASFs，RT-PCR分析表明，miR-16 mimic可明顯降低RASFs中MMP3及MMP13 mRNA的水平,見圖4A、B，同時MMP3及MMP13蛋白的水平明顯降低，差異有統計學意義，見圖4C。上述結果表明，miR-16可抑制RASFs中MMP3和MMP13的表達，提示其在緩解ECM的降解中具有重要作用。

Figure 2. Effects of miR-16 on the proliferation (A) and invasion (B) of RASFs. HPF: high-power field. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs control.

Figure 3. Effect of miR-16 on the apoptosis of RASFs.

5 miR-16對RASFs中炎癥因子的影響

與對照組相比，miR-16 mimic可明顯降低RASFs中IL-1β mRNA的水平，同時伴隨其蛋白表達水平的下調；而miR-16抑制劑則可顯著提高IL-1β的表達水平，見圖5。

Figure 4. Effect of miR-16 on the levels of MMPs expression in RASFs.A： relative mRNA level of MMP-3; B: relative mRNA level of MMP-13； C: protein expression of MMP3 and MMP13. Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

Figure 5. Effect of miR-16 on the mRNA (A) and protein (B) levels of IL-1β in RASFs.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control.

討 論

RA是一種以關節滑膜炎癥為病理特征的自身免疫性疾病，研究顯示RASFs的異常增生與RA的發生有著密切聯系。而miRNAs是近年來發現的一類調控生物體基因表達的重要分子，參與多種免疫細胞的活化和分化過程[6]。有文獻報道，與正常患者相比，RA患者血漿和滑膜液中miR-16濃度均顯著上升，其值分別為1.3×103pmol/L和1.5×102pmol/L[7]，提示miR-16可能在RA的病理進程中發揮重要作用。研究表明，多種miRNAs對RASFs增殖、侵襲均有影響。張曉萍等[8]發現miR-146a轉染可顯著抑制RASFs的增殖；Long等[9]發現miR-155也可抑制RASFs的增殖和侵襲。與上述研究結果相一致，本研究結果表明，miR-16 mimic能顯著抑制體外培養RASFs的增殖和侵襲，而miR-16抑制劑則可顯著促進RASFs的增殖和侵襲。提示miR-16通過抑制RASFs的增殖和侵襲從而緩解RA的發生。在骨肉瘤中，miR-16 通過靶向胰島素樣生長因子1受體抑制骨肉瘤細胞的增殖[10]；在非小細胞肺癌中，miR-16 通過靶向肝癌衍生生長因子抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[11]。我們推測在RASFs增殖、侵襲過程中，miR-16可能通過抑制某一靶基因的表達進而抑制RASFs增殖、侵襲，但miR-16在RASFs中調控靶基因還需要進一步研究。此外，細胞凋亡實驗表明miR-16對RASFs的凋亡沒有顯著影響，提示miR-16抑制RASFs的增殖并不是通過影響細胞凋亡實現的。

MMPs是一族鋅離子依賴性的內源性蛋白水解酶，它能降解細胞外基質蛋白，直接降解軟骨和骨質，從而造成RA病理過程中的骨質疏松和關節破壞[12]。MMPs家族中MMP3/13是導致軟骨降解的蛋白酶，其對RA的破壞作用主要在于軟骨活化后可導致軟骨連結蛋白、纖維連接素以及多種膠原酶等蛋白酶的降解[13]。本研究發現，miR-16 mimic可下調RASFs中MMP3及MMP13的表達水平，而miR-16抑制劑可上調RASFs中MMP3及MMP13的表達。有文獻報道，MMP的表達水平與RASFs的增殖和侵襲有著密切聯系[14]。因此，我們推測miR-16可能通過下調MMP3及MMP13的表達水平來抑制RASFs的增殖和侵襲。

TNF-α和IL-1β在RA發病中起著關鍵作用，這2種細胞因子通過刺激RASFs增生，分泌IL-6、趨化因子以及基質蛋白酶和前列腺素等效應分子，從而造成關節損害[15]。有文獻報道，miR-155可能通過抑制miR-155靶基因的表達，進而抑制RASFs增殖及IL-1β等炎癥細胞因子的分泌，從而發揮抑制RA滑膜炎癥的作用[8]。在本研究中，我們發現miR-16 mimic可下調RASFs中IL-1β的表達水平，而miR-16抑制劑可上調RASFs中IL-1β的表達。核轉錄因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化可增加IL-1的表達水平，從而促進軟骨細胞和滑膜細胞中MMPs和前列腺素PGE2的產生，進而抑制IV型膠原及蛋白多糖的合成，還可調控軟骨結構蛋白的表達[16]，因此，我們推測miR-16可能是通過抑制NF-κB的表達抑制RASFs增殖、侵襲及炎癥細胞因子的分泌。

綜上所述，miR-16在RA的發病中起著重要作用，除了抑制RASFs的增殖、侵襲外，還可抑制MMP3/13以及IL-1β的表達，但其具體機制還有待進一步研究。

[參 考 文 獻]

[1] Isozaki T, Rabquer BJ, Ruth JH, et al. ADAM-10 is overexpressed in rheumatoid arthritis synovial tissue and mediates angiogenesis[J]. Arthritis Rheum, 2013, 65 (1): 98-108.

[2]HuberLC,DistlerO,TarnerI,etal.Synovialfibroblasts:keyplayersinrheumatoidarthritis[J].Rheumato-logy(Oxford),2006,45(6):669-675.

[3] Stanczyk J, Ospelt C, Karouzakis E, et al. Altered expression of microRNA-203 in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and its role in fibroblast activation[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(2):373-381.

[4]NidererF,TrenkmannM,OspeltC,etal.Down-regulationofmicroRNA-34ainrheumatoidarthritissynovialfibroblastspromotesapoptosisresistance[J].ArthritisRheum, 2012, 64(6):1771-1779.

[5] Furer V, Greenberg JD, Attur M, et al. The role of microRNA in rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases[J]. Clin Immunol, 2010, 136(1):1-15.

[6]Duroux-RichardI,PresumeyJ,CourtiesG,etal.MicroRNAsasnewplayerinrheumatoidarthritis[J].JointBoneSpine, 2011, 78(1):17-22.

[7] Murata K, Yoshitomi H, Tanida S, et al. Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J]. Arthritis Res Ther, 2010, 12(3):R86.

[8] 張曉萍, 李 茹, 王世瑤, 等. 微小RNA-146a對類風濕關節炎患者滑膜成纖維細胞抑制作用的研究 [J]. 中華風濕病學雜志, 2010, 14(4): 220-222.

[9] Long L, Yu P, Liu Y, et al. Upregulated microRNA-155 expression in peripheral blood mononuclear cells and fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis [J]. Clin Dev Immunol, 2013, 2013: 296139.

[10]ChenL,WangQ,WangGD,etal.miR-16inhibitscellproliferationbytargetingIGF1RandtheRaf1-MEK1/2-ERK1/2pathwayinosteosarcoma[J].FEBSLett, 2013, 587(9): 1366-1372.

[11] Ke Y, Zhao W, Xiong J, et al. Downregulation of miR-16 promotes growth and motility by targeting HDGF in non-small cell lung cancer cells [J]. FEBS Lett, 2013, 587(18): 3153-3157.

[12]BlasioliDJ,MatthewsGL,KaplanDL,etal.ThedegradationofchondrogenicpelletsusingcoculturesofsynovialfibroblastsandU937cells[J].Biomaterials, 2014, 35(4):1185-1191.

[13] Yoon HY, Lee EG, Lee H, et al. Kaempferol inhibits IL-1β-induced proliferation of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts and the production of COX-2, PGE2and MMPs[J]. Int J Mol Med, 2013, 32(4):971-977.

[14]TolboomT,PietermanE,VanderLaanW,etal.Invasivepropertiesoffibroblast-likesynoviocytes:correlationwithgrowthcharacteristicsandexpressionofMMP-1,MMP-3,andMMP-10[J].AnnRheumDise, 2002, 61(11):975-980.

[15] Hu W, Xia LJ, Chen FH, et al. Recombinant human endostatin inhibits adjuvant arthritis by down-regulating VEGF expression and suppression of TNF-α, IL-1β production [J]. Inflamm Res, 2012, 61(8):827-835.

[16]PelletierJP,Martel-PelletierJ,AbramsonSB.Osteoarthritis,aninflammatorydisease:potentialimplicationfortheselectionofnewtherapeutictargets[J].ArthritisRheum, 2001, 44(6): 1237-1247.