兩種甲狀腺功能亢進癥動物模型的對比研究

劉樹民，崔曉旭，陳平平，王可心，汪 娜，柳長鳳

(黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江中醫藥大學北藥基礎與應用研究省部共建教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

甲狀腺功能亢進癥(簡稱甲亢)系指多種病因導致甲狀腺功能增強，甲狀腺激素分泌過所致的臨床綜合征[1]。臨床上主要有抗甲狀腺藥、手術、131I輻射治療等幾種方式，但均有一定的禁忌癥和副作用，近年來采用中醫藥治療甲亢在臨床上取得了較好的療效，而復制出穩定可持續的甲亢動物模型對于開發有效的治療甲亢的藥物是必不可少的，藥物治療大致分為預防給藥和治療給藥兩種方式，對于持續性好的模型可以采用治療給藥的方式，但如果持續性不好即恢復較快的模型，采用治療給藥的方式起不到評價藥效的作用，而應采用預防給藥的方式，基于此，本文從較經典的造模方法中選取了兩種造模方法：大鼠口服優甲樂[2-3]和小腸結腸炎耶爾森氏菌尾靜脈注射[4-5]免疫造模，復制這兩種甲亢動物模型，除常規的生化和病理指標檢測外，引入代謝組學技術，利用液質檢測模型尿液的代謝指紋圖譜，從代謝的整體變化評價模型，通過此研究比較了兩種不同方式復制模型的成型性及持續性，以期為研究治療甲亢的藥物提供良好的評價載體。

1 材料和方法

1.1 儀器

美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀；美國Waters LCT Premier XE飛行時間質譜儀；DFM-96型16管放謝免疫γ計數器，合肥眾成機電技術開發有限責任公司；CLASS TYPEB2生物安全柜，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；DC-160HR高速冷凍離心機，科大創新股份有限公司中佳分公司；HZQ-F160振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；DHP-9162電熱恒溫培養箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 試劑及制備方法

優甲樂(左甲狀腺素鈉片)：德國默克公司，生產批號147408，進口藥品注冊證H20100528，規格50 μg/片×100片；取優甲樂用蒸餾水配成濃度為50 μg/mL的混懸液；

小腸結腸炎耶爾森氏菌：由廣東環凱微生物科技有限公司提供，菌株標準編號：FSCC234002，批號：A0121B，有效期到：2014/08/25；取小腸結腸炎耶爾森氏菌菌種復蘇傳代后，在液體培養基中培養增菌，離心收集細菌沉淀后用0.03%甲醛溶液固定，最后用生理鹽水制備成濃度為5×108個/mL的細菌懸液；

放免試劑盒：濰坊三維生物工程集團有限公司，T3批號120815，T4批號130706，FT3批號130518，FT4批號130621；TSH批號130302，按說明書操作。

1.3 實驗動物

SD大鼠，雌性，體重200±20 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京) 2007-0001】；動物實驗在黑龍江中醫藥大學實驗動物中心完成【SYXK(黑)2008-001】，大鼠于屏障環境動物室內標準條件下飼養，大鼠適應環境1周后開始試驗。

1.4 動物模型的制備

1.4.1 優甲樂模型制備

取SD雌性大鼠20只，分為空白組和模型組，模型組灌胃給予優甲樂50 μg/100g鼠重，給藥21 d，空白組給予同等劑量的蒸餾水，于造模后第1、7、14天分別于眼底取血，全血樣品于4℃，3000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冷凍后待測，并于最后一次取血后取大鼠的甲狀腺組織于4%甲醛溶液中固定；同時于代謝籠中接取第1、7、14天的12 h尿液，尿液樣品于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清液進UPLC-MS檢測。

1.4.2 小腸結腸炎耶爾森氏菌模型制備

取SD雌性大鼠20只，分為空白組和模型組，模型組尾靜脈注射5×108個/mL的小腸結腸炎耶爾森氏菌細菌懸液免疫造模，注射時間為第0、5、10、15、20天共5次，給菌量分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL依次增多，空白組給予等量的生理鹽水造模，于末次注射后第5、15、25天大鼠眼底取血，全血樣品于4℃，3000 r/min離心10 min，取血清于-20℃冷凍后待測，并于最后一次取血后取大鼠的甲狀腺組織于4%甲醛溶液中固定；同時于代謝籠中接取末次注射后第5、15、25天的12 h尿液，尿液樣品于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清液進UPLC-MS檢測。

1.5 檢測項目及方法

1.5.1 常規指標檢測

實驗過程中觀察大鼠的外觀行為變化，監測體重，放免法檢測血清T3、T4、FT3、FT4、TSH的水平(委托黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院同位素放免室檢測)，HE染色檢查甲狀腺病理改變。

1.5.2 UPLC-MS檢測尿液代謝數據

1.5.2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLCTMBEH C18column(50 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm，Waters Corp，Milford，USA)；流速0.40 mL/min；柱溫：25℃；樣品倉溫度：4℃；流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件(表1)；色譜儀流出液不經分流直接注入質譜儀進行正離子掃描分析。

表1 UPLC梯度洗脫條件

1.5.2.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，采用正離子掃描檢測；毛細管電壓掃描為3000 V，樣本錐孔電壓為35 V；分離錐孔電壓為3.0 V；離子源溫度為110 ℃；脫溶劑氣溫度為350℃；準確質量校正采用亮氨酸-腦啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+=556.2771；掃描方式為全掃描，質量掃描范圍m/z100～1500。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠外觀行為

優甲樂模型：與空白組比較，模型組從第14天左右開始，出現煩躁不安、活動頻繁、飲水量多，鼠籠內潮濕，排泄物增多，毛發無光澤；造模后一周基本恢復正常。

小腸結腸炎耶爾森氏菌模型：與空白組比較，模型組于造模后第5天開始，出現煩躁不安、活動頻繁、飲水量多，鼠籠內潮濕，排泄物增多，毛發無光澤；至第25天時癥狀未見減輕。

2.2 體重

從表2可知，造模第1周，模型組體重出現負增長，與空白組比較有顯著的統計學意義，第2周、第3周，雖與空白組比較無統計學意義，但直觀數據觀察可看出增長緩慢，待到造模結束后2周，體重增長恢復到正常水平。

從表3可知，造模的前10 d模型組體重增長緩慢，與空白組比較有顯著性差異，第10～20天的時間段體重與空白組比較雖無統計學意義但增長緩慢，第20～30天的時間段體重差與空白組比較有統計學意義，第30天至實驗結束模型組體重增長恢復正常。

2.3 生化指標結果

從表4可知，造模后大鼠血清T3、T4、FT3、FT4與空白組比較均具有顯著性差異，恢復7 d的模型T3、T4、FT3、FT4均回到正常水平，而TSH與模型組比較無統計學意義。

表2 優甲樂模型體重變化

表3 小腸結腸炎耶爾森氏菌模型體重變化

表4 優甲樂模型生化指標結果

表5 小腸結腸炎耶爾森氏菌模型生化指標結果

從表5可知，造模后第15天時，模型組大鼠血清T3和T4與空白組比較有統計學意義，第25天時T3和T4與空白組比較仍有統計學意義，第25天時TSH與空白組比較有統計學意義。

2.4 病理

從彩插3圖1中可知，空白組甲狀腺濾泡大小基本一致, 呈圓形或橢圓形, 內充深紅色染膠質, 濾泡膠質染色均勻, 濾泡間質無水腫, 上皮細胞無增生；優甲樂模型組與空白組比較未見明顯改變，而小腸結腸炎耶爾森氏菌模型組，甲狀腺濾泡破壞, 組織有血管侵犯，上皮細胞脫落，增生，間有大量結締組織增生，少量的炎細胞存在。

2.5 代謝組學整體評價結果

大鼠尿液進UPLC-MS進行掃描檢測，12 min的BIP色譜圖顯示尿液樣品得到了良好的分離效果(圖2)，將各組的液相質譜色譜圖利用MassLynxV4.1工作站進行PCA分析，得到反應各組組間離散程度的Scores plot圖(圖3)。

圖2 大鼠尿液UPLC-MS檢測的BPI圖

注：A.優甲樂模型B.小腸結腸炎耶爾森氏菌模型。

從圖中可能看出，優甲樂模型組造模后，模型組與空白組比較明顯的偏離空白組位置，表明造模后內源性代謝發生非常明顯的改變，恢復期第7天時有回調的趨勢但仍然與空白組無交叉，而到14 d時在得分圖中與空白組重疊，表明模型基本恢復正常；小腸結腸炎耶爾森氏菌模型，造模后第5天、15天和25天的代謝改變基本上一致，均與空白組無交叉，表明模型內源性代謝被擾動并且保持在一定的狀態，說明此模型的持續性較好。

3 討論

復制甲亢動物模型的方法主要有以下幾種：(1)利用免疫方法構建誘發性甲亢動物模型，基本方法[6]是利用表達TSHR的細胞或質粒DNA或腺病毒免疫小鼠，此方法復制的甲亢動物模型成為當前研究甲亢發病機制的首選模型，但此種方法動物模型復制繁瑣，成模率不高；(2)利用外源性甲狀腺素刺激造成高甲狀腺素狀態動物模型，此模型是模擬臨床病癥的造模方法，不能作為病理機制研究的模型，但此模型的特點是簡單快速，成模率高，對于藥物療效的初步評價為首選模型。(3)小腸結腸炎耶爾森氏菌免疫模型，小腸結腸炎耶爾森氏菌是一種常見的感染因素，相關研究[7-9]表明小腸結腸炎耶爾森氏菌感染與甲亢的病情和復發率關系密切，因此，利用小腸結腸炎耶爾森氏菌尾靜脈免疫復制模擬甲亢發病機制的動物模型，成為當前較常用的甲亢動物模型。

對于評價和篩選治療甲亢的藥物及其療效，選擇和復制合適的甲亢動物模型至關重要，因此，本文選取了大鼠口服優甲樂和小腸結腸炎耶爾森氏菌尾靜脈免疫兩種甲亢動物模型進行對比研究，實驗結果表明，大鼠口服優甲樂造模后，相關指標顯示，模型復制成功，但1周后模型恢復至正常水平，說明外源性給予甲狀腺素的模型不具有持續性，此模型的特點的簡單快速，成模率高。而尾靜脈注射小腸結腸炎耶爾森氏菌后，相關指標顯示模型復制成功，并且模型持續近1個月，這與臨床甲亢的病程較長類似，此模型的特點是復制較繁瑣，合適的菌液濃度及正規熟練的尾靜脈注射對于成模至關重要。

本文采用常規指標并結合整體代謝變化綜合評價了模型的成型性及持續性，優甲樂模型為給予外源性甲狀腺激素造成高甲狀腺激素狀態，因此，此模型的病理指標改變明顯，并且代謝組學結果也顯示內源性代謝的改變明顯，此模型成型性好但持續性差，對于藥物療效的初步評價為首選模型，但要預防給藥方能起到評價療效的效果；而小腸結腸炎耶爾森氏菌模型是模擬甲亢的發病機制，是通過注射細菌后免疫而產生甲亢，相關病理結果及代謝組學數據符合甲亢的臨床病理表現，雖不如優甲樂模型相關指標改變明顯，但此模型持續性較好，用于評價藥物的療效可采用治療給藥的方式，即成模后再給藥治療，更符合臨床上用藥治療的規律，此模型亦可作為疾病機制研究的模型。

參考文獻：

[1] 陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].人民衛生出版社,2005:661.

[2] 胡方林,劉仙菊,易法銀,等. 內外合治對甲亢模型大鼠甲狀腺激素及甲狀腺病理改變的影響[J].中華中醫藥學刊,2009,27(3):543-545.

[3] 張子泰,侯英萍,汪靜,等. 用左旋T4建立大鼠甲狀腺功能亢進模型的實驗研究[J].西北國防醫學雜志,2006,27(1):34-36.

[4] 王慶浩,翟世偉,陳如泉. Graves病大鼠甲狀腺細胞中MAKP的表達及益氣養陰中藥對其影響[J].天津中醫藥,2004,21(2):151-153.

[5] 陶冬青, 復方甲亢片對Graves病大鼠T細胞亞群及其細胞因子失衡影響的實驗研究,博士學位論文[D],2005.

[6] 周瑾,李玉姝.Graves病動物模型及Graves病發病機制的研究進展[J].中國免疫學雜志，2010,26(8):758-763.

[8] Wang Z, Zhang Q, Lu J,etal.Identification of outer membrane porin f protein of Yersinia enterocolitica recognized by antithyrotopin receptor antibodies in Graves' disease and determination of its epitope using mass spectrometry and bioinformatics tools[J].J Clin Endocrinol MeTab. 2010,95(8):4012-4020.

[9] Hargreaves CE,Grasso M, Hampe CS,etal.Yersinia enterocolitica provides the link between thyroid-stimulating antibodies and their germline counterparts in Graves' disease[J].J Immunol. 2013,190(11):5373-5381.