復方紅景天制劑對高正加速度應激大鼠血清皮質酮及心肌組織糖皮質激素受體的影響

陳良恩，詹 皓，吳 峰，趙安東，楊明浩

(空軍航空醫學研究所，北京 100142)

持續高正加速度(positive acceleration，+Gz)作用可以導致機體劇烈的應激反應和血液動力學變化，激活神經內分泌系統。國內外大量研究表明[1-3],交感腎上腺素能系統、腎素血管緊張素系統、內皮素以及前列環素等在高+Gz應激時均會發生明顯變化。神經內分泌系統的改變有助于高+Gz應激時機體血流量的調節和血壓的保持，提高機體抗+Gz應激能力，但應激激素的分泌紊亂以及持續作用容易造成組織細胞的損傷[4]。復方紅景天制劑是由紅景天、黃芪、白芍、當歸等組成的中藥制劑，單體成分具有清除氧自由基、改善微循環及心血管功能、增強免疫力、提高機體抗應激能力等作用。前期研究表明[5-6]，該復方制劑對大鼠高+Gz應激導致的心腦損傷具有一定的保護作用。本文采用+10 Gz持續性作用建立大鼠+Gz損傷模型，通過觀察復方紅景天制劑對機體重要的應激激素-糖皮質激素(glucocorticoid，GC)及其受體(glucocorticoid receptor，GR)表達的影響，進一步揭示該制劑對高+Gz應激大鼠神經內分泌的調節作用，探討該制劑對持續正加速度致心肌損傷的相關保護機制。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

復方紅景天制劑，中國醫學科學院藥用植物研究所化學室提供，該制劑主要由紅景天、黃芪、當歸、白芍、丹參等成分組成，采用乙醇回流提取工藝提取復方有效成分。

1.2 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠72只，體重(200±25)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證:[SCXK(京) 2011-0004]；飼養于解放軍總醫院第304臨床部[SYXK(軍) 2007-011]。

1.3 試劑與儀器

兔抗大鼠GR多克隆抗體及GAPDH多克隆抗體，美國Santa Cruze 公司；過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，北京中杉金橋生物技術有限公司；超敏ECL化學發光試劑盒，北京科宇深藍科技有限公司；GC酶聯免疫檢測試劑盒，美國R&D公司；其余試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。動物離心機，長春奧普光電公司；Wellscan MK3全自動酶標儀，芬蘭Labsystems Dragon公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥

大鼠適應性喂養3 d后，采用抽簽法將大鼠隨機分為空白對照組、應激對照組、+10 Gz應激組和藥物低、中、高劑量組，每組12只，各組動物分籠飼養并作標記。各組動物每天上午灌胃給藥1次，連續14 d，給藥體積為20 mL/kg，每只動物每天灌胃前稱取體重以確定灌藥量，低、中、高劑量組大鼠每天分別按0.75 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg給予復方紅景天中藥制劑，其余3組動物給等量的生理鹽水。末次給藥當日20:00開始禁食，次日進行離心機暴露。

1.4.2 動物離心機暴露模型建立

采用動物離心機進行+Gz暴露，將大鼠束縛固定在通氣的動物艙中，置于離心機的轉臂上，大鼠頭部朝向離心機旋轉軸心。離心機半徑為2 m，由計算機進行加速度程序控制。實驗組大鼠暴露+10 Gz水平，持續5 min，加速度增長率為1G/s。空白對照組不做任何處理，應激對照組動物在離心機艙內轉臂上束縛5 min，不做離心處理。

1.4.3 大鼠血清GC測定

大鼠+10 Gz作用后4 h，麻醉，心臟取血，分離血清。采用GC酶聯免疫檢測試劑盒測定血清皮質酮濃度。

1.4.4 大鼠心肌組織GR測定

大鼠斷頭處死，速取心臟，用4℃生理鹽水沖洗，剪取大鼠新鮮的左心室肌組織，將組織稱量后切成幾個較小的組織塊，勻漿，使用哺乳動物組織總蛋白抽提試劑盒提取蛋白樣品，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白質含量測定，操作步驟按說明書進行。每個樣品取50 μg蛋白質加入等體積2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，經15%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉移至NC膜，1% BSA 封閉過夜，PBST洗膜兩次，加入1:800稀釋兔抗大鼠GR多克隆抗體，37℃孵育1 h，內參采用兔抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體。PBST洗膜，加1∶3000稀釋的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h，PBST洗膜。在NC膜上滴加超敏ECL化學發光試劑，然后在暗室中曝光X線片。采用Quantity One v4.6.2 軟件進行光密度值分析，GR蛋白的表達量以GR對應條帶與同組GAPDH 條帶的光密度值的比值表示。

注：1. 空白對照組; 2. 應激對照組; 3. +10 Gz應激組; 4. 藥物低劑量組; 5. 藥物中劑量組; 6. 藥物高劑量組。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 復方紅景天制劑對大鼠+10 Gz暴露后血清皮質酮濃度的影響

與空白對照組和應激對照組大鼠相比，+10 Gz應激組大鼠血清皮質酮濃度明顯升高(P< 0.01)。復方紅景天制劑劑量依賴式降低血清皮質酮濃度，藥物中劑量組和高劑量組大鼠血清皮質酮濃度明顯低于+10 Gz應激組(P< 0.05)(表1)。

2.2 復方紅景天制劑對大鼠+10 Gz暴露后心肌組織糖皮質激素受體表達的影響

大鼠心肌GR表達的western blot結果如圖1。測定各條帶光密度，分析各組大鼠心肌GR表達水平，結果如表2。+10 Gz應激組大鼠心肌GR的表達水平與空白對照組和應激對照組相比明顯降低(P< 0.01，P< 0.05)。復方紅景天制劑預處理大鼠心肌GR表達水平明顯升高，三個不同劑量的藥物組大鼠GR表達水平均顯著高于+10 Gz應激組(P< 0.05，P< 0.01)。

表1 各組大鼠血清皮質酮濃度的變化 (n=12)

表2 各組大鼠心肌組織GR蛋白表達變化 (n=6)

3 討論

當機體受到強烈刺激時，下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)的強烈興奮導致腎上腺皮質生成和釋放GC增加，導致血液中GC水平的升高。GC生物學效應的發揮取決于靶細胞上GR的介導。GR屬于激素核受體家族的主要成員，同時也是一種重要的核轉錄因子。游離的GC通過彌散進入細胞內，迅速與胞漿內GR 結合，此時受體被活化，激素受體復合物進而轉移到核內與靶基因的GC反應元件相互作用，調節靶基因的表達，并最終引起各種生物學效應[7]。GR的含量是細胞對GC反應的一個決定性因素[8]。

同以往對腎上腺素、去甲腎上腺素以及內皮素等其他應激激素的研究結果相似，高+Gz應激大鼠血清GC水平明顯升高，GC水平的升高對提高大鼠的抗+Gz應激能力有一定作用，它可以減少應激反應有害介質(緩激肽、蛋白水解酶、前列腺素等)的產生和釋放；使能量代謝以糖代謝為中心，保證葡萄糖對腦、心臟重要器官的供應；同時對兒茶酚胺的允許作用，使心肌收縮力增強，升高血壓。但高水平GC可以誘導細胞凋亡已被許多研究證實[9-10]。高+Gz應激大鼠心肌細胞和海馬神經元細胞凋亡的增多[11-12]，可能與高+Gz應激條件下GC水平升高有關。

本研究還發現，與空白對照和應激對照相比，高+Gz應激組大鼠GR表達水平明顯降低。有研究認為，應激情況下，GR的降低與血漿GC濃度的升高有關，GC對GR和GR mRNA均具有反向調節作用[13]。同時，也有研究認為GR的下調還存在以下幾種可能：激素受體復合物轉移到核內；應激時受體蛋白分解加速，而合成減少；糖皮質激素受體的結合活性降低[14]。此外，研究發現，應激狀態下炎癥因子如TNF、IL-1等也可以抑制GR的表達[15]。應激狀態下GR表達水平下調一定程度上可以降低靶細胞對激素的反應性，防止因激素的持續作用對靶細胞造成損傷[13]。但GR的降低會造成機體對GC的抵抗，繼發性的引起大量炎性因子分泌增多，導致嚴重的炎性反應的發生。在各種應激過程中，GR的減少可促使休克、多器官功能衰竭的發生，且糖皮質激素受體的減少幅度與病理性應激損傷嚴重程度平行[16]。

在本研究中，實驗觀察到復方紅景天制劑預處理可以降低高+Gz應激大鼠血漿GC水平，并且呈現劑量依賴性，提示該復方制劑對高+Gz應激大鼠神經內分泌系統具有一定的調節作用。進一步檢測心肌細胞GR表達水平，復方紅景天制劑預處理組大鼠心肌GR高于高+Gz應激組，并且也呈現劑量依賴性。GC濃度的降低和GR表達水平的升高，既增強了靶細胞對激素的敏感性，保證了應激狀態下GC的有效生理效應，同時也避免GC濃度過高導致的細胞凋亡。因此，該復方制劑對于保持高+Gz應激狀態下機體內環境的穩定、預防心肌細胞的損傷具有重要作用。有關復方紅景天制劑對GC和GR作用的確切機制，有待于今后進一步深入研究。

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