90K/Mac-2BP基因沉默增強HIV-1 感染的單核巨噬細胞凋亡

傅春燕，蔣 虹，薛 婧，叢 喆，陳 霆，魏 強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

艾滋病嚴重危害著人類的健康與生命。盡管在艾滋病防治的研究與實踐上已取得重大進展，但現有的藥物無法徹底治愈艾滋病，感染者仍需終身用藥，一旦停藥，體內的艾滋病毒載量將會快速反彈。造成停藥后體內艾滋病毒量快速反彈的重要原因是抗病毒治療不能完全清除艾滋病毒。一是由于抗病毒藥物較難進入病毒感染的細胞，二是由于病毒在一些細胞中能持久潛伏或行低度隱性復制。人們將病毒感染后不發生凋亡、病毒能在其內潛伏并在合適條件下復制的細胞稱為艾滋病毒潛伏感染靶細胞，而單核巨噬細胞是一類重要的潛伏感染靶細胞。因此，尋找清除艾滋病毒潛伏感染靶細胞的藥物及措施，是艾滋病防治研究的一個重要領域[1-2]。

巨細胞-2結合蛋白(也稱Galectin-3結合蛋白，90K/Mac-2BP)在人單核巨噬細胞中高表達，其能與半乳糖凝集素相互作用，發揮多種生物學效應[3-7]。其中最顯著的作用是與其受體結合介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質的相互作用[5, 8]。有研究表明淋巴瘤與90K/Mac-2BP 的粘附能夠抵抗化療誘導的細胞凋亡[9]。鑒于文獻報道90K/Mac-2BP能與Galectin-3相互作用[5, 10]，并具有一定的抗凋亡作用，我們對90K/Mac-2BP的表達水平是否能調節HIV-1感染單核巨噬細胞的凋亡進行了初步探索，這將為清除HIV-1潛伏感染靶細胞提供初步依據。

1 材料和方法

1.1 試劑及細胞

人單核巨噬細胞株U937(北京協和醫學院基礎研究所細胞中心)。PE-Annexin V/ PerCP-7-AAD凋亡檢測試劑盒(BD Pharmingen公司)。以90K/Mac-2BP為靶基因的3個siRNA(Origene 公司)，序列為：A-rArGrCrGrCrUrCrArGrCrUrUrCrArArGrArArAr UrUrArCTG；B-rArCrCrUrCrArCrCrGrArGrGrArUrAr CrCrUrArCrArArGCC；C-rArGrArCrGrUrCrArCrCrGr ArUrUrUrCrGrArGrGrGrCrUGG。小鼠抗人90K/Mac-2BP單克隆抗體(Origene公司)。HIV-1全長質粒(Clone:11739，R5 tropic)(NIH 提供)。轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen 公司)。細胞RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)。cDNA合成試劑盒、SYBR GREEN I熒光實時定量試劑盒(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

U937細胞于5%CO2、37℃細胞培養箱中培養。培養基為改良型RPMI-1640培養液(加入10%胎牛血清、200 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素)。處于對數生長期的細胞用于本實驗。

1.2.2 HIV-1病毒的制備

以NIH來源的HIV-1全長質粒(Clone:11739，R5 tropic)采用陽離子脂質體方法轉染293T細胞，12 h后更換新鮮培養基，72 h后收獲HIV-1病毒懸液。

1.2.3 HIV-1病毒感染U937細胞

將含有HIV-1的病毒懸液加入到U937細胞的培養基內，培養4～5 d后收集細胞；將收集的細胞用PE-AnnexinV和PerCP-7-AAD染色，流式細胞術檢測細胞凋亡[11-12]。

1.2.4 細胞凋亡的檢測

細胞凋亡的檢測利用PE-Annexin V/ PerCP-7-AAD凋亡檢測試劑盒[11-12](BD Pharmingen公司)，操作步驟參照試劑盒說明書。收集5×105個細胞于流式管中，冰預冷的PBS洗兩次，1×Annexin V Binding Buffer洗一次，棄上清后，輕輕彈起細胞，分別加入5 μL PE-Annexin V、5 μL PerCP-7-AAD，室溫下避光孵育15 min。加入300 μL 1×Annexin V Binding Buffer，在1 h內流式細胞儀(FACS Canto；BD)檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 90 K/Mac-2BP 基因沉默

將以90K/Mac-2BP為靶基因的siRNA利用陽離子脂質體方法轉染U937細胞，6 h后更換新鮮培養基，48 h后檢測基因沉默情況。

1.2.6 細胞RNA的提取和反轉錄

收獲細胞并用細胞RNA提取試劑盒(QIAGEN)進行總RNA提取，提取過程參照試劑盒說明書。使用分光光度計(NanoDrop 2000c，Thermo Scientific)檢測RNA的濃度和質量。提取RNA后立即對其進行反轉錄操作。反轉錄使用Prime Scrip 試劑盒(TAKARA)進行，操作過程參照試劑盒說明書。反轉錄獲得的cDNA于-20℃儲存備用。

1.2.7 利用熒光定量PCR檢測RNA的表達水平

根據GenBank上人90K/Mac-2BP和GAPDH序列，利用引物設計軟件Primer Premier 5.0進行人基因90K/Mac-2BP和GAPDH的引物設計。引物由Invitrogen公司合成。引物序列為：90K/Mac-2BP-F AACCCAAGGCGTGAACGATG；90K/Mac-2BP-RCTG GGTGGCGTTCTCGAAGC；GAPDH-FCTCCTGTTCGA CAGTCAGCC；GAPDH-RACCAAATCCGTTGACTCC GAC。退火溫度為60℃。所有樣本的熒光定量PCR檢測獲得的CT值數據后，利用ΔΔCT法計算各樣品基于內參基因的相對表達含量。

1.2.8 90 K/Mac-2BP蛋白表達的檢測

利用western blotting免疫印記法檢測。收集5×106個細胞，PBS洗一次，加入100 μL RIPA裂解液，冰浴30 min，13000 r/min 4℃離心30 min，取上清液。在酶標儀上用BCA法參照標準蛋白濃度，于562 nm處測定樣品的吸光值。根據蛋白定量的標準曲線計算各樣本的蛋白含量。

配制10%分離膠和5%積層膠，取80 μg蛋白樣品溶于相應體積的上樣緩沖液中，98℃煮沸5 min，蛋白變性后即可加樣。室溫下80 V電泳30 min，蛋白樣品到達分離膠后將電壓調為120 V，繼續電泳約1 h。配制電轉液，冰浴中300 mA電轉約1 h。將電轉后的NC膜置于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。隨后將膜放入一抗中4℃孵育過夜。第2天將膜置于TBST中清洗3次，每次10 min，再置入二抗中室溫孵育1 h。抗體如下稀釋：抗90K/Mac-2BP(1∶500)、抗β-actin(1∶15000)、HRP標記山羊抗小鼠(1∶20000)。與二抗反應后，將膜置于ECL發光液中3 min，放入化學發光分析儀進行檢測。結果用ImageJ 軟件分析蛋白條帶的相對密度。

1.2.9 統計分析

數據用GraphPad軟件分析，以均值±標準差表示。用Student's t-test對數據作統計處理，P< 0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 利用熒光定量PCR檢測U937細胞90K/Mac-2BP mRNA的表達

利用siRNA基因沉默技術，將U937細胞中的90K/Mac-2BP基因沉默，然后提取細胞RNA并進行反轉錄，利用熒光定量PCR技術，在RNA水平檢測基因沉默效果。圖1為熒光定量PCR檢測獲得的CT值，利用ΔΔCT法，即2-ΔΔCT計算得到的各樣本基于內參基因GAPDH的相對表達含量。結果顯示U937細胞轉染siRNA A后，在RNA水平90K/Mac-2BP基因的表達含量相比對照組下降了89.33%，其次為B下降了84.33%， C下降了48.00%。

注：與對照相比，*P < 0.05。

2.2 western blotting檢測U937細胞90K/Mac-2BP蛋白的表達

利用siRNA基因沉默技術，將U937細胞中的90K/Mac-2BP基因沉默。我們將針對90K/Mac-2BP基因的siRNA轉染至U937細胞，利用western blotting技術，檢測90K/Mac-2BP基因在siRNA轉染前后蛋白水平的表達情況。圖2A觀察到在內參β-actin基本表達一致的情況下，90K/Mac-2BP基因siRNA轉染后的U937細胞(A、B、C)的條帶相比對照條帶淺，說明90K/Mac-2BP達到了一定的沉默效果，其中A的沉默效果最為明顯。圖2B為western blotting的定量分析結果，結果表明與siRNA轉染前對照細胞相比，轉染A的U937細胞中90K/Mac-2BP的表達水平下降了59.62%，轉染B的U937細胞中90K/Mac-2BP的表達水平下降了40.38%，轉染C的U937細胞中90K/Mac-2BP的表達水平下降了34.38%。

注：與對照相比，*P < 0.05。

2.3 HIV-1感染90K/Mac-2BP 基因沉默的U937細胞凋亡增加

注：與對照相比，*P < 0.05。

Annexin V陽性代表發生凋亡的細胞。圖3A顯示90K/Mac-2BP基因沉默的U937細胞與對照U937細胞(8.03±0.25)%相比，凋亡率并沒有增加，分別為：(7.74±0.22)%，(9.07±0.47)%，(8.04±0.34)%，其與對照均無顯著差異，說明90K/Mac-2BP基因沉默對U937細胞本身的凋亡無影響。圖3B顯示正常的人單核巨噬細胞株U937，經HIV-1感染后細胞凋亡率為(16.27±0.30)%，而90K/Mac-2BP基因沉默的U937，經HIV-1感染后，細胞凋亡率分別增加至(31.62±0.35)%，(25.76±0.30)%，(23.69±0.34)%。圖3C結果顯示90K/Mac-2BP 基因沉默的U937細胞比正常的U937細胞經HIV-1感染后的凋亡率明顯增加(p﹤0.05)，說明90K/Mac-2BP的表達水平能夠調節HIV-1感染人單核巨噬細胞的凋亡，即90K/Mac-2BP表達量降低，HIV-1感染人單核巨噬細胞凋亡率升高。

3 討論

90K/Mac-2BP最初作為腫瘤相關抗原在人乳腺癌細胞培養上清中被檢測出來[13]，它由90×103的亞基組成，故名90K，并且它是半乳糖凝集素3(Galectin-3)的配體之一，由多種細胞合成分泌，其中包括造血細胞、上皮細胞等。90K的作用目前還沒有完全闡明，研究表明它可以增加殺傷細胞的活性、促進細胞因子的產生、腫瘤增長的抑制等，另外，在黑色素瘤中的研究表明，它可以通過與細胞表面Galectin-3的相互作用，增加細胞間的粘附[10]。通常情況下，正常人血清中90K/Mac-2BP的含量在μg/mL的范圍內，研究表明，血清中90K的高水平表達與某些腫瘤細胞的發生、增殖、分化和轉移有關[14]。文獻報道90K/Mac-2BP對于前列腺癌的診斷具有重要作用。另外，有研究報道，在HIV感染的病人中，血清中90K/Mac-2BP的表達增加[6]。然而，對于90K/Mac-2BP在HIV感染的過程中起到何種作用，尚未見有研究報道。

研究報道，HIV感染可使單核巨噬細胞抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-XL的表達增強，基因沉默Mcl-1、Bcl-XL等抗凋亡基因可以增強HIV感染的單核巨噬細胞發生凋亡[12]。本研究觀察到利用siRNA 基因沉默技術，使90K/Mac-2BP表達量降低后，HIV-1誘導單核巨噬細胞凋亡率明顯升高，提示了90K/Mac-2BP與HIV-1感染后單核巨噬細胞的抗凋亡能力有一定的關系。但其作用機制是否與調節促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白的表達相關，仍需進一步研究證實。鑒于Galectin-3作為90K/Mac-2BP的受體且具有抑制細胞凋亡的作用[15]，盡管尚未有報道，可以設想HIV-1感染單核巨噬細胞中的90K/Mac-2BP有可能通過與Galectin-3相結合而發揮作用。這個現象提示90K/Mac-2BP可能作為清除艾滋病毒潛伏感染單核巨噬細胞的一個值得深入研究的候選者。

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