無菌隔離技術在悉生生物學中的應用與發展

呂 陽

(中國疾病預防控制中心設備處，北京 102206)

1 悉生生物學與無菌隔離的概念

人和動物的體內通常會棲息著一些微生物。這些微生物群和寄主的關系以及它們彼此之間的關系十分復雜。無菌動物的出現，使人們研究動物體與單一細菌的關系成為可能。科學家也可以研究某兩個細菌之間的協同或者拮抗作用。如果某一生物體中沒有任何可檢出的其他生物，或者除少數棲息其中的已知生物外，不能再檢出其他生物，則這一生物體和棲息其中的已知生物之間的關系，無論是互利的或有害的，均形成一種悉生態。此時這一悉生態中的生物即為悉生生物。研究悉生生物以及由悉生生物構成的悉生態的生物學分支學科稱為悉生生物學。

利用悉生動物開展微生物學研究，可排除動物體內不明微生物對實驗結果的干擾，實驗數據的準確性得到明顯的很高。實踐證明，要獲取無菌動物或悉生動物，就必須解決無菌隔離技術。建立在無菌隔離技術基礎上產生的無菌動物、單菌動物、雙菌動物、多菌動物和特殊病原體動物總稱為悉生動物，廣泛應用于臨床醫學、預防醫學、藥學、食品工業微生物研究等不同領域，并取得了普通動物實驗所無法實現的豐碩成果。

2 無菌隔離技術的發展

2.1 傳統潔凈室技術

傳統的潔凈室將操作人員、操作環境和操作對象混在一個空間，很容易導致細菌污染，甚至導致活性物質的特性喪失。同時，傳統的潔凈室無法保證人員在操作高毒性物質過程中的安全，也無法保證環境不被污染。另外，傳統的潔凈室還存在長期運行維護成本高、風險大、驗證困難等問題。

2.2 限制進出屏障系統(RABS)

是繼傳統的潔凈室技術后較早興起的一種無菌隔離技術。美國FDA對RABS的定義為“A physical partition that affords aseptic processing area(ISO5)protection by partially separating it from the surrounding area”，即通過一個物理的隔斷將無菌操作區域(A級)與周圍環境(B級)隔離開，以給無菌操作區域提供保護[1]。RABS將操作過程中要求的A級環境與周圍B級環境采用物理屏障隔開，減少了不同潔凈級別之間、操作人員與A級環境之間的交叉污染(圖1)。

圖1 RABS示意圖

根據配備高效過濾器的方法不同，RABS可以分為被動式RABS和主動式RABS。其主要區別在于，被動式RABS的A級環境與周圍B級環境的潔凈室共用高效過濾器(圖2)；而主動式RABS，其A級環境配備有獨立的高效過濾器(圖3)。

圖3 主動式RABS模式圖

根據氣流的運行方式不同，RABS又可以分為開放式RABS和封閉式RABS。其主要區別在于，開放式RABS，是將A級環境的氣流直接排入周圍B級環境的潔凈室中(圖4)；而封閉式RABS，其配備有自循環氣流通路，氣流在封閉的A級環境中內循環，不會排放到周圍B級環境的潔凈室內(圖5)。

圖4 開放式RABS

圖5 封閉式RABS

2.3 無菌隔離器技術

是在限制進出屏障系統RABS出現之后又發展起來的一種更為先進的無菌隔離技術。FDA對無菌隔離器的定義為“A decontaminated unit，supplied with class 100(ISO5)or higher air quality，that provides uncompromised，continuous isolation of its interior from the external environment(e.g. surrounding cleaning room air and personnel)”，即一種使用百級以上的清潔空氣氣流，絕對、連續地將內部環境(操作環境)和外部環境(如周圍的潔凈室空氣和人員)隔開以隔絕污染的裝置。就是說無菌隔離器技術是采用完全密閉的裝置將操作空間(A級環境)與周圍環境完全隔離，并配備相應的空氣處理單元(包含高效過濾器)以及過氧化氫滅菌裝置，可以自動完成裝置內部的環境滅菌、空氣凈化處理等工作，具有極高的安全性，如圖6所示。

圖6 無菌隔離器系統示意圖

目前，在悉生生物學研究中發現，實驗和生產環境對潔凈度要求越來越高，主要是以下兩個方面的要求：

(1)無菌動物、悉生動物及悉生態本身需要無菌環境；

(2)實驗和生產對象要求避免環境微生物污染，必須保證實驗和生產操作過程在無菌環境下完成。

另外，隨著生物安全管理的日益嚴苛，病原菌研究的隔離措施也越來越嚴。無菌隔離技術不僅可以防止環境微生物污染研究對象，也可以防止正在研究的病原菌污染環境。因此，在實驗環境國標(GB14925)中，隔離環境是分為正壓和負壓的[2]。

無菌隔離器已發展壓力為正負壓的各種類型的無菌隔離器系統，包括隔離艙體、空氣處理系統、過氧化氫噴霧消毒自動滅菌系統、雙門快速無菌環境傳遞系統等。隔離器內的潔凈度能夠達到5級，保障隔離器內的無菌環境。國家食品藥品監督管理局規定，在藥品生產和檢驗中使用的隔離系統，應配備7級或更高級別潔凈空氣過濾裝置，并使內部環境與外環境完全隔離[3]。隔離器的艙體屏障對操作人員提供了安全有效的防護，使操作人員徹底地從傳統的潔凈室中解放出來；同時無需龐大的凈化系統支持，艙內外完全的隔離，使無菌隔離器在一般清潔環境中可隨意移動，相當于一個可移動的、高潔凈級別的微型實驗室。

3 無菌隔離器的優勢與應用

無菌隔離器技術與傳統潔凈室、限制進出屏障系統(RABS)相比，具有明顯的優勢：

(1)避免安全風險

傳統的潔凈室，由于操作環境與周圍環境沒有物理隔離，容易產生交叉污染。另外，操作人員直接在潔凈室中工作，人員本身會導致固體顆粒的產生和對潔凈室層流的破壞。其中，人員、環境極易與高活性、高毒性的樣品接觸，不利于保護人員的安全。事實證明，潔凈室內的微生物和固體顆粒濃度也只能控制在10-3的水平[4]。

開放式RABS系統，A級的操作環境與B級的潔凈室被物理屏障隔開，操作人員采用手套操作，很大程度減少了潔凈室環境交叉污染的可能性，在保證產品質量和保護人員的安全方面都有非常好的效果。但是，由于開放式RABS與潔凈室共用同一高效過濾器的空調系統，雖然控制微生物和粒子污染的能力增強，但還是存在交叉污染的可能性。

封閉式RABS系統，A級的操作環境內部配備有獨立的空氣凈化單元，且RABS內部的空氣為循環使用，將人員、環境與產品幾乎完全隔離開來，所以避免微生物和粒子污染風險的安全性大大提高。實踐證明，可以使用封閉式RABS系統進行一些易變質、高活性和高毒性的樣品測試或生物制品的生產。然而，檢測數據表明，封閉式RABS的A級操作環境與外部環境之間仍然不能夠達到標準要求的絕對隔離，還需要外部環境潔凈空間作為背景。

與傳統潔凈室和RABS不同的是，無菌隔離器系統能夠將A級的操作環境與外部環境和人員完全隔離。操作環境內部不僅配備單獨的高效過濾器，而且還配備有獨立空氣處理單元，相當于一個獨立的潔凈空間，同時還配有過氧化氫滅菌系統，可以獨立對其箱體內表面和設備表面進行滅菌。因此，無菌隔離器可以完全擺脫周圍環境也需要凈化處理的背景限制，簡化了無菌操作的復雜性。

(2)降低成本

1)建筑成本：由于RABS與傳統潔凈室建筑上相同，需要B級環境為背景，因此建筑費用沒有很大區別。而對于無菌隔離器來說，由于B級的環境背景不再是必需條件，傳統潔凈室中的B級背景部分可以取消，從而降低了建筑成本。

2)設備成本：由于RABS是在傳統潔凈室中增加了RABS，必然導致設備成本高于潔凈室，而無菌隔離器系統由于加裝了過氧化氫處理系統和獨立的空氣處理單元，因此設備成本較其他方式要高。

3)運行成本：RABS與傳統潔凈室相比沒有改變任何的潔凈級別，因此其能源消耗(主要為空調系統，包括空氣處理、溫度和濕度的控制)、潔凈服的使用成本等均相同，同時由于RABS的引入又帶來更多的監測項目如RABS手套的檢查、空調系統的檢測等，因此RABS的運行成本會略高于傳統潔凈室。而無菌隔離器因為不存在B級環境，可以大大減少能耗、檢測設備以及人工。因此，無菌隔離器是三者中運行成本最低的。據測算，傳統潔凈室的運行費用是隔離器的3倍[5]。

通過以上分析可以看出，在避免污染風險方面，無菌隔離器安全性最高；在成本投入方面，無菌隔離器雖然設備本身成本較高，但因為降低了建筑費用和基礎設施費用，所以總固定資產投資成本最低；在運行成本方面，無菌隔離器因沒有了B級環境背景從而簡化了無菌操作的復雜性，故運行成本最低。

因為無菌隔離器本身的特點和優勢，在世界范圍內已經得到了越來越廣泛的應用。發達國家在制藥、生物制品等行業標準方面有關裝備的描述中，都有對無菌隔離器的定義和要求。無菌隔離器與超凈工作臺連接使用，可以最大程度保證實驗操作的安全性[6]。

2011 年3月1日我國制藥行業實行了新版GMP。在新版GMP中對無菌藥品的生產要求更加嚴格，首次提出了無菌藥品生產隔離概念，提出無菌藥品生產工藝，明確了生產工藝對應環境級別的要求，自動化進出料和隔離化的環境控制已成為藥品生產不可逆轉趨勢，無菌隔離器必然起到關鍵的作用。同時，隨著我國生物領域研究水平的發展，無菌隔離器在國內悉生生物學科領域中逐漸得到推廣，許多生物科學工作者根據研究需要也都開始引進和使用無菌隔離器系統。

4 結語

綜上所述，相對于傳統潔凈室和RABS而言，無菌隔離器具備安全性高、投入運行成本低的特點。隨著我國政府對實驗動物使用、藥品生產的要求日益嚴格，無菌隔離器已在我國制藥行業得以普及。我國隨著新GMP 的施行，逐漸與國際GMP接軌，無菌隔離器技術將是無菌隔離技術的最重要發展趨勢。隨著現代生物科學的發展，無菌隔離器技術與自動化技術相結合是當前中國悉生生物學研究手段的一個發展方向，其宗旨是通過無菌隔離以及對操作者限制進出的干預，從而降低悉生生物受到外界環境污染；另一方面，在進行有毒性或高致敏性實驗時，可以有效地保證操作人員的生物安全。

參考文獻：

[1] Quality Risk Management for Aseptic Processes, PDA Technical Report 2008，44(62)： S-1.

[2] 全國實驗動物標準化技術委員會.實驗動物環境及設施[S].北京：中國標準出版社，2011：3-4.

[3] 衛生部.藥品生產質量管理規范(2010年修訂)[S]. 北京：衛生部2011第79號令.

[4] 馬偉、孫石磊.無菌隔離器的優勢及其發展趨勢[J].中國制藥裝備，2013，(7)：33-36.

[5] Beyeler N. Porter.M “Barrier Isolator Cost Analysis Revisited”ISPE,2009 Wastington Conference June 1 2009 Arlington,VA.

[6] 李志滿，田之寧.無菌隔離器與超凈工作臺、潔凈層流柜的直連改造嘗試[J].實驗動物科學，2010,27(4)：68-69.