PLCε基因敲除小鼠移植性肝癌模型的建立與分析

李曉娟，靳雪源，白冰珂，李 蓓，侯 俊，李瑞生

(1．解放軍第302醫院實驗技術研究保障中心，北京 100039；2．解放軍第302醫院國際肝病診療中心，北京 100039)

原發性肝癌是我國乃至全球的高發惡性腫瘤之一，死亡率很高[1]，目前仍缺乏有效的治療手段，因此闡明肝癌的發病機制對于研發新的藥物治療靶點具有十分重要的意義，而肝癌動物模型又是研究肝癌致病機理和抗癌新藥的重要平臺[2-3]。研究發現磷脂酶Cε(PLCε)是癌基因產物Ras及抑癌基因產物Rap的新效應蛋白[4]。Kataoka實驗室利用敲基因技術建立了PLCε敲基因小鼠，并且發現PLCε-/-小鼠的皮膚乳頭瘤發生率明顯下降[5]。為了進一步了解PLCε-/-小鼠的抗癌特性。本實驗利用PLCε敲基因型(PLCε-/-)和野生型(PLC+/+)小鼠進行肝內注射的方法來建立移植性肝癌動物模型，以期再次驗證PLCε-/-小鼠具有抗癌的特性，從而為深入研究肝癌致病機制提供了良好的研究平臺，也為臨床肝癌的新藥研發提供了新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

PLCε基因敲除小鼠由日本合作引進到解放軍第302醫院動物實驗室，該實驗室飼養環境為SPF級，實驗動物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。隨機選取PLCε-/-(敲基因型)15只和PLCε+/+(野生型)小鼠30只，6～8周齡，單鼠體質量(18～20)g，均為雄性。

1.2 細胞株制備

H22肝癌細胞株由中心實驗室提供，將H22肝癌細胞株復蘇后腹腔接種于小鼠體內，7 d后無菌抽取H22肝癌細胞株腹水，生理鹽水洗滌，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，臺盼藍染色計數，生理鹽水調整癌細胞數至1×108/mL備用。

1.3 實驗分組及肝癌模型制備

隨機選取15只PLCε+/+小鼠為對照組，選取15只PLCε+/+鼠為模型組I，15只PLCε-/-鼠為模型組II。造模方法：小鼠用速眠新(1 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，備皮，在胸骨下緣2 cm處沿腹中線向上剪開皮膚約1 cm，分離并剪開腹膜，暴露肝臟，輕壓腹部擠出肝臟左葉，濕紗布墊于肝葉下方以保護，用注射器吸取H22細胞懸液0.2 mL，刺入肝被膜下的肝實質內，刺入深度約2～ 3 mm，緩慢注入后拔出針頭，用棉球輕壓注射部位，防止細胞外溢及出血。將肝臟回納入腹腔，縫合切口[6]。對照組以同樣的方法注入生理鹽水。術后正常采食飲水。

1.4 形態學觀察

術后需每日觀察各組小鼠的活動狀態，第15天處死全部小鼠，觀察模型組肝臟腫瘤生長情況，用游標卡尺測量肝臟腫瘤長、短徑，按公式[7]計算腫瘤體積(V)：V=a × b2/2(a為長徑，b為短徑)。選取對照組正常肝臟組織與兩個模型組的肝臟腫瘤組織置入4%甲醛固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察其形態學。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件對模型組I與模型組II的腫瘤體積進行兩組獨立樣本t檢驗分析。

2 結果

2.1 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤成功率分析

手術后各組小鼠狀態均良好。對照組、模型組I和II的小鼠均未出現死亡，存活率均為100%。在手術后第15天處死全部小鼠，開腹觀察，小鼠均未出現腹水。模型組I的15只小鼠肝臟表面全部有單個灰白色病灶，腫瘤移植成功率為100%。模型組II的15只小鼠有8只小鼠的肝臟表面有單個灰白色病灶，腫瘤移植成功率為53.3%(表1)。

2.2 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤觀察分析

對照組小鼠肝臟外觀正常，未發現有結節病灶。模型組I的15只小鼠的肝臟表面全部有單個灰白色病灶，腫瘤體積平均為 (65.21±5.25)mm3。模型組II的15只小鼠中有8只小鼠的肝臟表面有單個灰白色病灶，腫瘤體積平均為 (23.46±3.47)mm3。模型組I的腫瘤平均體積明顯大于模型組Ⅱ(P<0.05)，(表1)，各組小鼠的肝臟外觀(圖1,見彩插2)。

表1 模型組小鼠肝癌腫瘤移植成功率及腫瘤體積分析

2.3 PLCε敲基因小鼠肝移植瘤組織形態學分析

光鏡下對照組小鼠肝細胞索結構完整，肝小葉結構清晰，肝細胞胞漿均勻，無壞死和炎性浸潤。而模型I組和II組光鏡下可見腫瘤組織呈巢狀，肝小葉組織已經完全破壞，腫瘤灶內瘤細胞豐富，排列擁擠。瘤細胞異型性明顯，胞漿豐富，嗜酸性，核圓形，核仁清楚，核分裂像多見。局灶見壞死，瘤細胞間可見裂隙樣血管，部分瘤細胞圍繞血管生長，局部見瘤細胞侵犯血管壁(圖2，見彩插2)。

3 討論

原發性肝癌臨床上還缺乏有效的治療手段，因此建立一個優質的動物肝癌模型對于探索人類肝癌治療新方法有很大的價值和意義[8]。目前建立移植性小鼠肝癌動物模型方法主要有皮下移植和原位移植，皮下移植雖然制備過程簡單方便，易于觀察，但瘤細胞的生長環境與肝臟內部腫瘤存在很大差異[9-10]。而肝癌的原位移植能夠較好地模仿人肝癌體內的血供和生長環境，提供與肝癌病人相似的肝癌生物學特性，更好地反映出抗癌基因和藥物的藥效學指標[11-12]。因此本實驗采用原位移植的方法，以期建立PLCε敲基因小鼠移植性肝癌動物模型。

PLCε是PLC家族新成員，具有特異性的Ras相關結構域和氨基端Ras鳥苷交換因子(GEF)結構域[13]。Bai等[5]在化學致癌物誘導皮膚癌過程中發現PLCε-/-小鼠具有抑癌作用，姜泰茂等[14]研究發現化學誘導膀胱癌的過程中PLCε-/-小鼠也具有抑癌作用，提示PLCε可能參與了腫瘤的形成過程。因此本實驗采用PLCε敲基因型(PLCε-/-)和野生型(PLCε+/+)小鼠進行肝內注射的方法來建立移植性肝癌動物模型并進行對比分析，結果顯示PLCε+/+組和PLCε-/-組形成的肝臟腫瘤具有典型性，均呈單個灰色結節狀，而且病理結果顯示呈肝細胞癌病變。但PLCε-/-組的腫瘤移植成功率為53.3%，明顯低于PLCε+/+組的腫瘤移植成功率100%，而且PLCε-/-組的腫瘤體積也顯著小于PLCε+/+組(P<0.05)。由此可見，再次證實PLCε-/-小鼠具有抗癌特性，提示PLCε在腫瘤的發生發展過程中發揮著非常重要作用。此結果與崔智[15]等采用化學致癌物誘導建立PLCε-/-小鼠肝癌模型的結果相一致，但本實驗采用的肝內移植方法建立的肝癌動物模型，顯著縮短了成模的時間，能夠更快速有效地為肝癌疾病的研究提供模型動物，這樣大大縮短了研究周期且提高了研究效率。

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