基于紫貽貝Mytilus galloprovincialis表達序列的核受體家族分析

李娟 ，李崇德

（1.國家海洋局北海環境監測中心，山東 青島 266033；2.中國科學院海洋研究所，山東 青島 266071；3.國家海洋局北海海洋工程勘察研究院，山東 青島 266033）

貽貝屬物種在世界范圍內廣泛分布，并且在濱海生態系統中有著重要的作用，研究較多的物種包括 Mytilus edulis，M.galloprovincialis，M.trossulus和M.californianus等。根據英文俗稱M.edulis更接近于紫貽貝（bluemussle），M.galloprovincialis因其在地中海周邊分布而被稱為地中海貽貝（Mediterraneanmussle）。兩者在歐洲呈馬賽克式分布，并在邊界處存在一定程度的種間雜交。前者分布在緯度較高的地區，如蘇格蘭，英格蘭中、北部，而后者分布在低緯度地區，如英格蘭南部，法國沿海等地。M.trossulus則被認為可能是分布于歐洲更為古老物種 （V?in?l?et al，1991；Varvio et al，1988）。加利福尼亞貽貝M.californianus個體較大，主要分布于北美西部沿海地區，在南美也有分布，主要生活在潮間帶（Suchanek，1981）。根據2008年出版的《中國海洋生物名錄》 （劉瑞玉，2008），M.galloprovincialis的中文種名是紫貽貝，也有文獻稱其為地中海貽貝（申望等，2011）。該物種自然分布于我國遼寧、河北、山東等省沿海地區。20世紀70年代人工養殖獲得成功后，浙江多地紫貽貝養殖業發展迅速。現在紫貽貝不僅是我國重要養殖品種，也已成為世界范圍研究海洋生物的種群分化、物種形成和環境監測的一個非常有意義的模式種（李巧梅等，2013；沈玉幫等，2011）。當前氣候變化加劇、污染事件頻發，深入研究貽貝對各種污染物及在不同脅迫壓力條件下的生存狀態尤為重要，而無論是對毒性物質的應激反應機制，還是生殖繁育和物種分化機制等貽貝基礎生物學研究，都有賴于重要物種數據的不斷積累。轉錄表達數據代表生物體在特定組織某一時期的基因狀況，是各類生物基礎問題研究的窗口。近年來，大規模cDNA測序工作在許多物種中開展，公共平臺數據劇增，大量的表達數據可以部分反映相應物種轉錄本的結構，進而有助于探討相應基因和基因家族的結構和特征。

核受體（nuclear receptor，NR）有時也被稱為核激素受體，是一個古老的基因家族，廣泛存在于腔腸動物、節肢動物和脊椎動物等各種多細胞動物中，是成員組成極復雜的一類轉錄調節因子。它們參與生命活動的各種功能，如體內穩態平衡、生殖、發育、代謝等（de Lera etal，2007；Germain et al， 2006； Huang et al， 2010； Laudet et al，2001）。核受體是受配體激活的轉錄因子，它們作為眾多激素與靶位點的中間橋梁將信號分子和應答性的轉錄反應過程直接聯系。脊椎動物中性腺激素受體以及甲狀腺激素受體都是這一基因家族的成員。核受體基因家族的大部分成員具有共同的結構特點，一個典型的核受體分子從N端至C端分可以為A/B功能區、C區、D區和E區。A/B功能區的可變性最大，其中包含至少一個非配體依賴性的轉錄激活位點即激活功能元件1（active transactivation region（AF-1））和幾個自助轉錄激活區（transactivation domains（AD））。位于特定位置的酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基能受不同信號轉導通路相關激酶作用而磷酸化，從而影響受體與配體的親和力和轉錄活性。核受體最保守的是C區中的DNA結合區（DNA-binding domain，DBD），及E區中的配體結合區（ligand binding domain，LBD），C區與E區之間是保守性較差的作為鉸鏈連接它們的D區。E區為多功能區，是核受體最大的部分，包括數個亞區和基序，除配體結合口袋（ligand binding pocket，LBP），E區還含有核受體二聚體化區和配體依賴性轉錄激活功能元件2（AF-2）（Robinson-Rechavietal，2003）?？傮w來說，DBD和LBD是核受體中兩個最保守的結構域，也往往被用作核受體基因鑒定和分類的典型結構序列。為了避免不同物種核受體家族成員名稱的混亂，1999年由國際藥理學委員會和受體命名與藥物分類聯合會專門成立了核受體命名委員會并在Cell發文提出核受體系統命名法則（Nuclear Receptors Nomenclature Committee,1999）。此后發現的新的核受體家族成員也都按此規則再進行系統性的命名。盡管結構相似，核激素受體卻有著與類固醇激素，成型素（維甲酸）、食物組分（脂肪酸）等不同化合物結合并調控下游通路的能力，在生物體內多種多樣的生理功能、代謝途徑中行使著重要的作用（Escriva etal，2000；Robinson-Rechaviet al，2001）。

本研究通過對公共數據庫中紫貽貝M.galloprovincialis轉錄數據的拼接和比對，以模式物種核受體特征序列為參考獲取紫貽貝核受體的編碼序列，進一步通過系統進化分析明確編碼產物的結構和在基因家族中的進化位置，從而全面分析該物種這一重要基因家族的組成和結構。本研究不僅為研究紫貽貝核受體功能研究提供寶貴信息，也有助于紫貽貝遺傳分化、生長繁育等生物問題的深入探討。

1 材料與方法

1.1 紫貽貝轉錄數據的預處理

通過NCBI（NationalCenter forBiotechnology Information）EST數據庫搜索，目前紫貽貝（M.galloprovincialis）共有19 617條EST序列。在EBI（The European Bioinformatics Institute）的 ENA（European Nucleotide Archive）數據庫 （M.galloprovincialis）有60 282條序列。將上述序列下載，并以各核受體基因名稱為關鍵詞搜索公共數據庫中該物種的核酸和蛋白序列。通過Cross_match去除EST數據的載體序列，使用軟件Cap 3對所有序列進行拼接構建本地紫貽貝核酸數據庫。

1.2 紫貽貝核受體預測

下載人的48個核受體基因編碼蛋白序列（人的核受體在不同亞家族都有分布并具代表性），通過PFAM結構域分析，使用bioperl提取最為保守的DBD結構域和LBD結構域序列，對已進行拼接的紫貽貝核酸數據庫進行本地tBLASTn。無論之前是否有基因注釋，對所有E-value小于0.001的序列進行BLASTx同源基因比對并采用InterPro程序（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）進行蛋白結構預測。

1.3 系統進化分析

將紫貽貝核受體與人Homo sapiens、果蠅Drosophilamelanogaster核受體序列的DBD和LBD結構域序列（根據PFAM數據庫預測）分別提取形成構建系統進化樹的序列文件。相關的GenBank序列碼為：CAA31709，AAF51627，CAA34626，AAN11687， AAF51692， AAA28461， AAF52702，AAC46928， AAF45707， Q24142， AAB71371，AAF58145， AAF52303， AAF54133， AAL37554，AAF53914， AAN11667， AAN11107， AAX73355，AAH11564， AAH30207， AAH08851， AAI06931，AAH08727，AAH60794，AAA63254，AAB32649，AAA36469，AAH06811，AAH56148，AAH45613，AAH08831，AAH93774，AAA64751，AAV38218，NP_009052， AAI30574， AAB95155， AAD05436，AAY56401，NP_849180，NP_004124，AAI10999，AAC18599，AAA80681，AAA36761，NP_003289，AAL05871，AAD28301，AAH04154，AAH42897，AAH02669， AAI28575， AAV31779， AAH63795，AAC99409，EAW93335，AAH15610，AAA59571，AAA60081，EAX05380，CAG32985，AAH09288，CAI95138， AAH32501， AAI18572， AAB96828。通過CLUSTALX進行蛋白序列的比對，輔以手工校正。以貝葉斯推斷法（Bayesian Inference）進行系統進化分析。貝葉斯系統進化樹采用MrBayes 3.2.1軟件構建（Ronquistetal，2003；Ronquistet al，2012）。起始樹設為隨機樹（random），馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markovchain Monte Carlo process，MCMC）設置為4條鏈（3條熱鏈，l條冷鏈）同時運行5×106代，每100代對系統樹進行抽樣，最終得到50 001棵系統發育樹，burnin frequency為10%以確保MCMC的收斂。

2 結果與討論

2.1 紫貽貝中核受體序列

在預處理的紫貽貝轉錄數據中，共獲得29條能夠編碼核受體特征序列（DBD或LBD）的轉錄本，最短的編碼49個氨基酸，最長的編碼678個氨基酸，命名為類核受體成員MgNRl1-29。根據InterPro程序分析，其中10條序列編碼1個DBD和1個LBD結構域，12條序列只有1個DBD特征序列，6條序列只有LBD特征序列，值得注意的是，我們發現1條編碼2個DBD的轉錄本（MgNRl6），在其C端是1個不完整的LBD序列，形成DBD1-DBD2-LBD結構。Wu等（2007）在曼氏血吸蟲Schistosomamansoni中首次發現了這類新的非典型的核受體成員，相似的核受體在渦蟲Schmidtea mediterranea和 Dugesia japonica、帽貝Lottia gigantea中也存在，這提示核受體與靶基因DNA序列的相互作用可能存在新的機制。

圖1多序列比對結果顯示，不同DBD結構域之間的序列相似性較高（包括MgNRl6的2個DBD結構域），大部分含有8個保守的半胱氨酸氨酸殘基，并形成了兩個鋅指結構，即C-X2-CX13-C-X2-C（鋅指 1）和 C-Xx-C-X9-C-X2-C（鋅指2），每個鋅指由4個半胱氨酸和中心部位的一個鋅離子鰲合而成，這與其它的典型核受體的DBD結構相同，是與特定DNA位點結合的部分。鋅指1相關的P-box也十分保守，參與核受體與DNA結合的過程。鋅指2相關的D-box則相對多變，這是在核受體自身及與其它成員二聚化中起作用的結構，兩個保守半胱氨酸之間的氨基酸5-7個不等。在S.mansoni中D-box此處（Xx）有3-9個氨基酸（Wu etal，2011）。另一重要結構域LBD不及DBD保守，但它們的高級結構十分相似，都是由 12個 α 螺旋構成的 （Moras et al，1998）。LBD是響應內外激素或其他配體信號的功能域。已有的研究普遍認為，配體結合特性是在核受體的進化過程中獲得的（Bertrand et al，2004）。有的LBD不具有功能性的LBP，無法結合配體，可能是真正的孤兒受體（Baker etal，2003；Codina et al，2004；Flaigetal，2005）。

圖1 紫貽貝核受體DNA結合結構域的多序列比對

2.2 系統發育分析

本研究通過構建貝葉斯系統進化樹對紫貽貝核受體進行分析。貝葉斯推斷法和最大似然法（Maximum Likelihood）緊密相關，不過它衡量分支的支持率所用的MCMC法要比似然法的自展法速度快，已經在大數據量的分子進化分析廣泛應用（Huelsenbeck et al，2001）。因核受體家族是一個古老的成員眾多的基因家族，借鑒蚤狀溞Daphnia pulex基因家族分析方法，采用了中點定根法（Thomson etal，2009）。如圖2所示，根據DBD序列構建的貝葉斯樹中，NR0、NR3、NR4亞家族及NR2的主要組別分別匯到一起，NR5和NR6亞家族匯成一支，而NR1亞家族的成員分散分布。根據LBD序列構建的貝葉斯樹中，7個亞家族成員分別聚合，形成更為清晰的分支，最后聚到一起。27個紫貽貝核受體的進化關系較為明確，其中屬于NR1亞家族的序列最多，為19個，占65.5%，其中包括HR96、E75、ROR以及2DBD-NR的同源基因；5個屬于NR2亞家族，包括HNF4、RXR、TLL、SVP的同源基因；2個屬于NR3亞家族，分別與ESR、ERR同源；還有1個屬于NR5亞家族，與人NR5A2最為相近。我們在分析過程中發現一些核受體的部分序列極其相似，但臨近序列差異較大，推測可能是同一基因由于可變剪切產生的不同轉錄本（例如MgNRl26和MgNRl27）。已經進行全基因組測序的長牡蠣Crassostrea gigas的核受體成員就普遍存在可變剪切現象。但根據現有的數據不能完全排除由不同拷貝的同源基因分別轉錄形成或不同個體發生變異產生的可能。

在軟體動物核受體的相關研究中，最受關注的是ESR（estrogen receptor，雌激素受體）和RXR（retinoid X receptor，維甲酸X受體）。很多軟體動物都具有雌激素受體同源基因，紫貽貝核受體MgNRl23在進化關系上也與人雌激素受體十分接近，但目前一般認為軟體動物的ESR同源基因并不像高等動物那樣能夠與雌激素特異結合。海兔中ESR同源基因的研究表明其能與多種類固醇及外源物質發生作用，可能作為感受器存在（Thornton etal，2003）。一些軟體動物中這一核受體是組成型表達的并且似乎與雌激素并不結合（Baker etal，2007；Keay etal，2006；Thornton etal，2003）。章魚ESR同源基因的分子結構模型研究顯示存在空間沖突使它不可能與雌激素結合（Baker et al，2007）。腹足類軟體動物作為內分泌干擾模型被廣泛研究，一些種類對環境污染物有機錫非常敏感，雌性個體會被誘導形成雄性性器官和輸精管，出現性 逆 轉 （imposex）現 象 （Gibbs et al，1988；Horiguchietal，1997）。RXR在三丁基錫誘導的蚵巖螺Thais clavigera中表達上調，特別是在卵巢和性逆轉形成雄性性器官的組織中（Horiguchietal，2010）。對荔枝螺Nucella lapillus、鳳螺Babylonia japonica、鮑Haliotismadaka以及H.gigantea的研究均支持RXR在有機錫誘導腹足類性逆轉機制中發揮著重要作用（Codina et al，2004；Horiguchi，2006）。紫貽貝的類雌激素受體、類維甲酸X受體及其它核受體的生理作用，對毒性物質的應激反應機制還有待更深入的功能性研究。

圖2 核受體的貝葉斯系統進化樹

Baker KD,Shewchuk LM,Kozlova T,etal,2003.The Drosophila orphan nuclear receptor DHR38 mediates an atypical ecdysteroid signaling pathway.Cell,113(6):731-742.

BakerM E,Chandsawangbhuwana C,2007.Analysis of 3D models of octopus estrogen receptor with estradiol:evidence for steric clashes that prevent estrogen binding.Biochemical and Biophysical Research Communications,361(3):782-788.

Bertrand S,Brunet FG,Escriva H,etal,2004.Evolutionary genomics of nuclear receptors：from twenty-five ancestral genes to derived endocrine systems.Molecular biology and evolution,21(10):1923-1937.

Codina A,Benoit G,Gooch JT,etal,2004.Identification of a novel coregulator interaction surface on the ligand binding domain of Nurr1 using NMR footprinting.The Journal of Biological Chemistry,279(51):53338-53345.

de Lera A R,BourguetW,Altucci L,etal,2007.Design of selective nuclear receptormodulators：RAR and RXR as a case study.Nature ReviewsDrug Discovery,6(10):811-820.

Escriva H,Delaunay F,Laudet V,2000.Ligand binding and nuclear re-cep tor evolution.Bioessays,22(8):717-727.

Flaig R,Greschik H,Peluso-Iltis C,et al,2005.Structural basis for the cell-specific activities of the NGFI-B and the Nurr1 ligand-binding domain.The Journal of Biological Chemistry,280(19):19250-19258.

Germain P,Staels B,DacquetC,etal,2006.Overview of nomenclature of nuclear receptors.Pharmacological Reviews,58(4):685-704.

Gibbs PE,Pascoe P L,Burt G R,1988.Sex change in the female dogwhelk,Nucella lapillus,induced by tributyltin from antifouling paints.Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom,68(4):715-731.

Horiguchi T,2006.Masculinization of femalegastropodmollusks induced by organotin compounds,focusing onmechanism of actions of tributyltin and triphenyltin for development of imposex.Environmental Sciences,13(2):77-87.

Horiguchi T,Nishikawa T,Ohta Y,etal,2010.Time course of expression of the retinoid X receptor gene and induction of imposex in the rock shell,Thais clavigera,exposed to triphenyltin chloride.Analytical and BioanalyticalChemistry,396(2):597-607.

Horiguchi T,Shiraishi H,Shimizu M,et al,1997.Effects of triphenyltin chloride and five other organotin compounds on the developmentof imposex in the rock shell,Thais clavigera.Environmental Pollution,95(1):85-91.

Huang P,Chandra V,Rastinejad F,2010.Structural Overview of the Nuclear Receptor Superfamily：Insights into Physiology and Therapeutics.Annual Review of Physiology,72:247-272.

Huelsenbeck JP,Ronquist F,Nielsen R,etal,2001.Bayesian inference of phylogeny and its impact on evolutionary biology.Science,294(5550):2310-2314.

Keay J,Bridgham JT,Thornton JW,2006.The Octopus vulgaris estrogen receptor is a constitutive transcriptional activator：Evolutionary and functional implications.Endocrinology,147(8):3861-3869.

Laudet V,Gronemeyer H,2001.The nuclear receptor factsbook.Academic Press.

Moras D,Gronemeyer H,1998.The nuclear receptor ligand-binding domain：structureand function.Current Opinion in CellBiology,10(3):384-391.

Nuclear Receptors Nomenclature Committee,1999.A unified nomenclature system for the nuclear receptor superfamily.Cell,97(2):161-163.

Robinson-Rechavi M,Carpentier A S,Duffraisse M,et al,2001.How many nuclear hormone receptors are there in the human genome?Trends in Genetics,17(10):554-556.

Robinson-RechaviM,Garcia H E,Laudet V,2003.The nuclear receptor superfamily.Journal of CellScience,116(4):585-586.

Ronquist F,Teslenko M,van der Mark P,et al,2012.MrBayes 3.2：efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space.Systematic Biology,61(3):539-542.

Suchanek TH,1981.The role of disturbance in the evolution of lifehistory strategies in the intertidal mussels Mytilus edulis and Mytilus californianus.Oecologia,50(2):143-152.

Thomson SA,BaldwinW S,Wang YH,etal,2009.Annotation,phylogenetics,and expression of the nuclear receptors in Daphnia pulex.BMCGenomics,10：500.

Thornton JW,Need E,Crews D,2003.Resurrecting the ancestral steroid receptor：Ancient origin of estrogen signaling.Science,301(5640):1714-1717.

V?in?l?R,Hvilsom M,1991.Genetic divergence and a hybrid zone between Baltic and North Sea Mytilus populations(Mytilidae：Mollusca）.Biological Journal of the Linnean Society,43(2):127-148.

Varvio S L,Koehn R,V?in?l?R,1998.Evolutionary genetics of the Mytilusedulis complex in the North Atlantic region.Marine Biology,98(1):51-60.

Wu W J,LoVerde P T,2011.Nuclear hormone receptors in parasitic helminths.Molecularand Cellular Endocrinology,334(1-2):56-66.

WuW J,NilesEG,HiraiH,etal,2007.Evolution of a novel subfamily of nuclear receptors with members thateach contain two DNA binding domains.BMC Evolutionary Biology,7:27.

李巧梅,王清,于倩,等,2013.As(Ⅲ）暴露對紫貽貝抗氧化酶活性和脂質過氧化的影響.海洋通報,32(4):429-433.

劉瑞玉,2008.中國海洋生物名錄.北京:科學出版社.

申望,葉茂,王日昕,等,2011.舟山海域外來物種地中海貽貝的自然分布現狀及生態影響.臺灣海峽,30(2):250-256.

沈玉幫,張俊彬,馮冰冰,等,2011.基于線粒體COI序列分析對紫貽貝群體遺傳多樣性的研究分析.海洋通報,30(4):435-440.