應用激光多普勒成像技術測量皮瓣成活面積的準確性分析＊

王友彬 吳煥文 肖一丁 高春錦 劉雪華 趙 嶺 劉蘊琦 王曉軍 馬雪梅

皮瓣成活面積的測量是皮瓣研究的重要內容，其 測 量 方 法 有 紙 模 法［1，2］、照 片 圖 像 分 析法［3，4］等。隨著微循環測量技術的發展，人們開始研究根據組織循環血流狀況確定組織成活的測量方法［5］，但用微循環灌注量來評估皮瓣成活情況以及這種判斷結果是否與皮瓣的組織學成活狀況相符合的研究目前未見報道。本文通過激光多普勒成像（LDI）技術和紙模法測量皮瓣成活面積的比較以及皮瓣組織病理學分析，評估用LDI微循環灌注方法判斷皮瓣成活面積的準確性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠12只，體重250g-350g。大鼠在SPF級動物實驗室飼養，環境溫度22℃-25℃，實驗過程中自由攝取飼料和飲水。

1.2 皮瓣手術方法

實驗大鼠采用10%水合氯醛（0.3ml／100g）腹腔注射麻醉后，將腹部剃毛并設計大小約6cm×9cm的皮瓣。術區消毒鋪巾，將皮瓣沿設計線切開，顯露雙側腹壁下淺動脈，結扎并切斷左側動靜脈，形成以右側腹壁下淺動脈為蒂的腹部擴大皮瓣；用顯微血管夾阻斷皮瓣血供3h，恢復皮瓣血供后將皮瓣原位縫合；皮瓣下置相應大小的硅膠片。術后第5天每只大鼠均采用LDI和紙模法測量皮瓣成活面積，觀察皮瓣邊緣組織病理學變化。術后切口及皮瓣用無菌敷料包扎保護。

1.3 皮瓣成活面積測量方法

1.3.1 LDI測量法：用激光多普勒血流儀（LDF，PeriScan PIM3，Perimed AB，Sweden）完成。皮瓣手術后第5天，大鼠按上述方法麻醉后仰臥固定，充分暴露皮瓣部位，測量時環境溫度保持在22-25℃。將LDF探頭置于皮瓣區上部，設定觀測范圍為11.0cm×7.5cm大小，包括皮瓣及周圍正常皮膚。對設定區域的皮膚血流灌注量進行測量后，LDF自動報告測定范圍內不同部位皮膚血流量數據及不同顏色的圖像。紅色代表皮瓣血流灌注量最大，黑色代表最小甚至沒有血流灌注，黃色和藍色介于二者之間。圖像顏色和皮瓣成活情況的關系是：紅色、黃色以及與二者相連的藍色區域視為皮瓣成活區，黑色視為皮瓣壞死區，藍黑交界處視為皮瓣成活與壞死分界線。根據該分界線用移動鼠標在圖像上人工標定皮瓣成活區（即紅、黃和相鄰部分藍色區域），其面積值由與LDF配套連接的計算機自動計算生成（圖1）。

1.3.2 紙模測定法：LDI測量完成后，肉眼觀察皮瓣成活區（微紅白色）和壞死區（黑灰色），將透明描摹紙覆蓋在皮瓣上，用有色筆在紙上描出皮瓣壞死和成活范圍（圖2），通過掃描儀（HP M1536dnf，深圳）將成活皮瓣范圍掃描成圖像，用與掃描儀配套的Acrobat 7.0分析軟件計算皮瓣成活面積。

1.4 皮瓣組織病理學分析

1.4.1 HE染色：于皮瓣邊緣，即成活區和壞死區交界處取1×1cm2大小組織塊，經甲醛（10%）固定、包埋、切片后行常規HE染色。光鏡觀察皮瓣成活與壞死組織的病理學表現，以驗證皮瓣成活區標定準確性的組織學依據。

1.4.2 CD34染色：用于觀察皮瓣組織內微血管形態。采用免疫組化Envision二步法，染色過程中設陽性及陰性對照。上述標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，徠卡切片機連續切片（厚5μm）。切片常規脫蠟、水化，經H2O2處理，阻斷內源性過氧化酶。用山羊血清（北京中衫金橋公司，批號ZLI-9056）封閉處理后，依次滴加CD34鼠抗人單克隆抗體（北京中衫金橋公司，批號ZM-0046）和Envision二抗 （丹麥Dako生物制品有限公司，批號K4001），DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察。內皮細胞CD34表達于微血管內皮細胞，呈棕黃色。

1.5 統計學處理

數據用SPSS 17.0統計分析軟件進行統計學分析。皮瓣成活面積測量結果用均數±標準差（±s）表示，兩種測量方法的結果比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種測量方法皮瓣成活面積比較

LDI技術測得的成活皮瓣面積為（10.19±3.27）cm2，紙模測量法測得的成活皮瓣面積為（10.21±3.15）cm2。兩種方法測值比較，差異無統計學意義（t＝0.29，P＞0.05）。但由于大鼠腹部立體結構在紙模法測量時會對描繪圖形產生影響，而LDI技術測量時結果幾乎不受大鼠腹部立體結構的影響，因此兩法劃定的皮瓣和存活區范圍有一定差異。

2.2 成活皮瓣邊緣組織HE染色和CD34染色結果

2.2.1 HE染色：成活皮瓣邊緣內側均可見正常皮膚組織，而外側出現明顯炎性損傷組織，其真皮及皮下組織中有較多急性及慢性炎性細胞浸潤，伴血管擴張充血，表皮角質層剝離、棘層增厚以及局灶性壞死形成（圖3）。

2.2.2 CD34染色：成活皮瓣邊緣內側正常皮膚和皮下組織內微血管形態正常，血管腔多為類圓形；而外側多數微血管管腔擴張、變形，部分血管閉塞，呈條索狀（圖4）。

［本文圖1-圖4見封2］

3 討 論

在進行皮瓣研究時，皮瓣成活面積和成活率是重要的參考指標［6］。為確定皮瓣的成活面積，一些研究者先用紙模記錄成活皮瓣的大小、形態，然后用面積分析軟件計算成活面積的大小［1，2］，這種方法的測定結果存在對成活情況判斷的主觀誤差。用數碼相機記錄皮瓣成活情況，然后用面積分析軟件計算成活面積較前者簡便［3，4］，但同樣存在對皮瓣成活情況判斷的主觀誤差。根據組織血供判斷皮瓣成活狀況并進行成活面積測定比上述方法更準確。隨著LDF的發展和普及，其在皮瓣成活情況監測方面的應用越來越受到重視［5］。

LDI系統由激光光源發射器、快速接收器以及分析軟件組成。激光被組織特別是組織血管中運動的紅細胞散射，散射的光束因多普勒效應產生一定的波長變化，通過對這些光束的接收分析，即可測出紅細胞的流動速度［7］。因此，LDI系統能較好地監測皮瓣的微循環血流灌注，判斷皮瓣組織成活情況［8］，從而較準確地測量和計算皮瓣成活面積。

本實驗結果顯示，用紙模法和LDI兩種方法測定皮瓣成活面積，其結果無顯著差異。但和紙模法相比，用LDI技術測量皮瓣成活面積是通過皮瓣組織血流確定的，與通過主觀判斷確定成活邊界的紙模法比較，測量結果更客觀。另外，皮瓣邊緣皮膚組織的HE和免疫組化染色顯示，成活皮瓣有正常的血管形態和組織結構，而壞死區組織呈現血管擴張和管腔閉塞，皮膚組織炎性浸潤和局灶性壞死，不可能給予皮瓣組織正常血供。這與LDI顯示的壞死皮瓣局部血流量明顯低于成活皮瓣相一致，為LDI測量成活皮瓣面積提供了組織學依據，即根據LDI確定的皮瓣成活面積，與實際成活皮瓣范圍基本一致。采用LDI技術測量皮瓣成活面積的方法準確可靠。

為保證LDI技術測量的準確性，在用鼠標劃定成活皮瓣范圍時還需仔細觀察皮瓣大體成活情況。因為LDI測定的是真皮下的血流，當皮膚壞死變薄時，LDI圖像會因為深部正常組織的血流被測及而呈正常皮膚血流的顏色，從而產生較大的誤差。所以在操作時應仔細觀察掃描光斑在皮瓣上的位置及其相對應的圖像顏色，盡量使鼠標劃定的顏色范圍與活體上真正成活皮瓣的面積一致。

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