利用酶抑制速測儀檢測桑葉農藥殘留方法探討

董久鳴 陳偉國 孫海燕 楊一平 張 芬

(1浙江省農技推廣中心，杭州 310020;2海寧市蠶桑技術服務站，浙江海寧 314400)

桑園及周邊農作物使用農藥污染桑葉極易導致養蠶中毒損失，如何快速、有效檢測桑葉中農藥殘留是保障蠶桑生產安全的重要措施。農藥殘留檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法翻，但儀器昂貴、處理繁瑣、耗時較長，對儀器的使用條件和操作人員的要求比較嚴格，只適用于實驗室檢測。近年來，隨著對快速檢測方法的需求，以酶抑制法為代表的快速檢測方法因具有高效、快捷、經濟、實時、現場、覆蓋率高等特點得到迅速發展，已在蔬菜、水果等農產品質量安全監管中得到廣泛應用，檢測對象為目前使用量最大的有機磷和氨基甲酸酯兩大類農藥。已被國家標準GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量快速檢測》、GB/T 18630—2002《蔬菜中有機磷及氨基甲酸酯農藥殘留量的簡易檢驗方法酶抑制法》和農業行業標準NY/T 448—2001《蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法》所采用。目前，國內市場上已有20多家生產商研制的具有農藥殘留快速檢測功能的儀器裝備40多種［1-5］。近年來，我們將農藥殘留速測儀應用于桑葉農藥殘留的快速檢測，以探索蠶桑生產安全防范的新措施。

1 酶抑制率法檢測農藥殘留的原理

利用有機磷和氨基甲酸酯類農藥對動物體內乙酰膽堿酯酶(AChE)具有抑制作用的原理，在AChE及其底物乙酰膽堿(ACh)的共存體系中加入檢測樣品的提取液，如果樣品中不含有機磷或氨基甲酸酯類農藥(或殘留量低)，酶的活性就不被抑制，ACh就會被酶水解，水解產物與加入的顯色劑反應產生黃色物質;反之，如果檢測樣品的提取液中含有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥，酶的活性就被抑制，試樣中加入的底物就不能被酶水解，當加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計在412nm 下測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出檢測樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農藥的存在［2，6］。抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=［(ΔAo-ΔAt)/ΔAo］×100

式中:ΔAo—空白對照溶液反應3min 吸光度的變化值，ΔAt—檢測樣品溶液反應3min 吸光度的變化值。

2 試劑與儀器

2.1 儀器

分光光度計或相應的農藥殘毒快速檢測儀，常量天平，冰箱，振蕩器。

2.2 試劑

緩沖溶液 11.9g 無水磷酸氫二鉀與3.2g 磷酸二氫鉀，用1 000mL 蒸餾水溶解。

顯色劑 160mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg 碳酸氫鈉，用20mL 緩沖溶液溶解，4℃冰箱中保存。

底物 25.0mg 硫代乙酰膽堿，加3.0mL 蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存備用。保存期不超過兩周。

乙酰膽堿酯酶 根據酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min 的吸光度變化ΔAo 值應控制在0.3 以上。搖勻后置4℃冰箱中保存備用，保存期不超過4 天。

各種農藥殘毒快速檢測儀生產商均可供應相應的試劑和配制方法。

3 檢測方法

3.1 空白對照測試

將2.5mL 緩沖溶液加入試管中，再加入0.lmL酶液、0.1mL 顯色劑、0.lmL 底物，迅速搖勻后倒入比色皿，立即放入儀器比色池中，記錄反應3min 的吸光度變化值ΔAo。

3.2 樣品處理

選取有代表性的桑葉樣品，用清水沖洗表面塵泥，剪成1～2cm 寬的長方條，稱取1g 樣品，放入提取瓶中，加入5mL 緩沖溶液，振蕩1～2min 后靜置待用。

3.3 樣品溶液測試

在試管中加入2.5mL 樣品提取液，其它操作與空白對照溶液測試相同，記錄反應3min 的吸光度變化值ΔAt。

3.4 檢測結果的判定

檢測結果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。當檢測樣品提取液對酶的抑制率≥50%時為陽性，表示樣品中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農藥存在;當檢測的抑制率≤50%時為陰性，表示樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農藥不存在或含量很低。目前使用的農藥殘留快速檢測儀大多具有檢測結果自動判定顯示功能，抑制率≥50%時顯示為不合格，抑制率≤50%時顯示為合格。

4 酶抑制法快速檢測桑葉農藥殘留應用前景

酶抑制率檢測方法的優點主要是前處理簡單、檢測時間短，所需儀器和試劑價格低廉，特別適合在短時間內對大批樣品的篩選檢測。目前，農貿市場和無公害農產品生產基地大多已配備此類檢測設備。但在應用于桑葉農藥殘留檢測時，尚需結合蠶桑生產特點。

4.1 檢測對象的局限性

酶抑制法只能檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留，不能檢測有機氯、擬除蟲菊酯、抗生素等其它農藥。因此，以酶抑制法的檢測結果并不能作為對家蠶安全的唯一依據，當然在明確檢測有機磷和氨基甲酸酯類農藥的情況除外。

4.2 檢測結果的適用性

不同植物的組織液、次生物質、葉綠素等都會干擾酶的反應，改變吸光度，影響檢測結果［7-8］。GB/T 5009.199—2003 是針對蔬菜樣品，以抑制率≥50%為陽性結果，表示農藥殘留超標(不合格)。但這一判定標準是否適用于桑葉上農藥殘留量對家蠶生物毒性的評判尚需進一步驗證。

4.3 檢測方法的可行性

盡管酶抑制法快速檢測桑葉農藥殘留存在一些不足，但并不能否定其應用價值。GB/T 5009.199—2003 中規定了酶抑制率法對部分農藥的檢測靈敏度指標，如辛硫磷為0.3mg/kg，敵百蟲為0.2 mg/kg，滅多威為0.1mg/kg;而這些農藥對家蠶的急性毒性(LC50)為辛硫磷0.887 2 mg/L、敵百蟲11.120 0mg/L、滅多威9.200 9mg/L［9-10］。可見，酶抑制率法對部分有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢出限明顯低于其對家蠶的急性毒性，因此，作為預知檢測手段具有可行性。

4.4 需要解決的主要問題

一是探索針對桑葉特點的檢測方法，減少各種干擾因素，上提高檢測準確度和可靠性。桑葉表面塵土對透光度的影響，桑葉樣品提取過程中組織液滲出的多少，不同部位桑葉的葉綠素差異，多種因素都有可能對比色結果產生干擾。需要經過大量對比試驗，提出適用性較強的優化檢測方法，降低出現假陽性現象。

二是建立有機磷和氨基甲酸酯類農藥主要品種的殘留檢測結果與對家蠶的生物毒性對應數據庫。由于各種農藥的內吸、揮發、降解等性質差異，在桑葉上的殘留量和降解時間相差極大，對家蠶的毒性等級也不一樣。因此，利用酶抑制法快速檢測桑葉中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留結果必須與對家蠶的殘毒期生物測定相對應，對主要的農藥品種建立比對數據庫，對檢測結果提出校正參考值。

三是正確應用好酶抑制檢測技術，為預防家蠶農藥中毒提供有效的輔助手段。應當認識到引起家蠶農藥中毒的復雜性，和酶抑制檢測技術的局限性，因此要揚長避短，發揮優勢。目前有機磷和氨基甲酸酯類農藥約占70%［1］，在危險時期、危險區域，對桑葉農藥殘留進行快速篩查，并結合生物試驗，可有效降低家蠶中毒風險，促進蠶桑生產穩定，使傳統產業繼續為農業增效、農民增收發揮積極作用。

［1］欒云霞，李楊，平華等.基于酶抑制法的農藥殘留快速檢測儀器現狀及評價［J］.食品安全質量檢測學報，2012，3(6):690-694.

［2］GB/T.5009 199—2003.蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量快速檢測［S］.2003.

［3］GB/T 18630—2002.蔬菜中有機磷及氨基甲酸酯農藥殘留量的簡易檢驗方法酶抑制法［S］.2002.

［4］NY/T 448—2001.蔬菜上有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘毒快速檢測方法［S］.2001.

［5］陳威，鐘國才，王亞軍等.基于酶抑制的有機磷農藥殘留快速檢測方法進展［J］.廣東農業科學，2011，(23):153-154.

［6］王惠，吳文君，潘燦平等.農藥分析與殘留分析［M］.北京:化學工業出版社，2007.

［7］杜美紅，孫永軍，汪雨等.酶抑制—比色法在農藥殘留快速檢測中的研究進展［J］.食品科學，2010，31(17):462-466.

［8］趙華.分光光度法快速檢測有機磷農藥殘留的研究［D］.北京:北京工業大學，2006.

［9］陳偉國，孫海燕，郁志華.不同劑型辛硫磷對家蠶的毒性比較［J］.廣西蠶業，2013，50(1):33-36.

［10］陳偉國，孫海燕，錢銀川等.農藥滅多威不同劑型產品對家蠶的毒性評價［J］.蠶業科學，2011，37(3):0574-0578.