堿性成纖維細(xì)胞生長因子對染鉛大鼠海馬神經(jīng)元胞漿ERK的保護(hù)作用*

吳攀峰，焦 銘，孫慧榮，吳基良，**

(1．武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，湖北 武漢 430071；2.湖北科技學(xué)院糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室；3.武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院心內(nèi)科)

鉛是一種嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，會影響人體各系統(tǒng)的器官，主要是神經(jīng)系統(tǒng)和造血系統(tǒng)[1]。更為嚴(yán)重的是鉛影響嬰幼兒的生長和智力發(fā)育，損傷認(rèn)知功能、神經(jīng)行為和學(xué)習(xí)記憶等腦功能，嚴(yán)重者造成癡呆[2]。目前認(rèn)為鉛能影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶C的活性及表達(dá)，進(jìn)而對大腦的學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生危害[3]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是FGF家族中重要的生長因子類，在神經(jīng)細(xì)胞的生長和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[4]。有研究表明，bFGF對老年性癡呆患者的皮膚成纖維細(xì)胞具有保護(hù)作用[5]。本實驗利用經(jīng)過bFGF和醋酸鉛處理過的原代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞，通過測定ERK活力的變化，來研究鉛對神經(jīng)元正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響以及bFGF對細(xì)胞中ERK活性的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 新生1～3 d的SD大鼠(購于武漢大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號No.42000500001044)。Galaxy 170S型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Eppendorf有限公司)，LS-6500型液閃儀(美國Beckman公司)，UV-2550型紫外-可見分光光度計(島津有限公司)等。多聚賴氨酸、ELK-1融合蛋白等購自Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Cellgro公司。bFGF購自麒寶生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 選擇新生1～3 d的SD大鼠，無菌條件下斷頭處死，取海馬區(qū)腦組織，D-hank's液中剪碎，用0.125%胰酶在37 °C消化約20 min。用含10%胎牛血清的DMEM溶液終止消化，制成單細(xì)胞懸液并離心2次，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基洗滌并懸浮，以2×109cell/L的細(xì)胞濃度加入已鋪多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，在37 °C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h以后棄培養(yǎng)液，改為2% B27無血清培養(yǎng)液，每72 h半數(shù)更換培養(yǎng)液。

1.2.2 鉛損傷神經(jīng)元模型建立與分組 將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞生長均一化，加入醋酸鉛溶液，使染鉛終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L。另外預(yù)先用終濃度0.6 μg/L的bFGF處理細(xì)胞1 h，然后加入上述濃度的染鉛溶液處理細(xì)胞30 min。細(xì)胞處理以后于-80 °C冰箱凍存。

1.2.3 胞漿中ERK活性的測定 采用改良的Takai法[6]，并用Lorry法檢測蛋白質(zhì)含量。牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制蛋白質(zhì)濃度測量標(biāo)準(zhǔn)曲線。ERK活性以比活力表示，先測定ERK的基礎(chǔ)活力(即未經(jīng)過鉛或bFGF處理)并除以ERK蛋白質(zhì)量以標(biāo)準(zhǔn)化，再測經(jīng)鉛或bFGF處理后的ERK的活力并同樣標(biāo)準(zhǔn)化，以后者比前者即得ERK比活力。每組檢測5次。

2 結(jié) 果

2.1 不同染鉛濃度對大鼠海馬神經(jīng)元ERK比活力的影響 將不同濃度醋酸鉛(0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L)與海馬原代神經(jīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)30 min后，在鉛濃度為0～2.0 μmol/L之間，隨鉛濃度升高，ERK比活力也隨之升高。在鉛濃度2.0 μmol/L時，ERK比活力達(dá)到最大，為空白組的7.885倍；鉛濃度上升到4.0 μmol/L后，ERK比活力隨之降低，但是仍然高于空白組，如表1所示。

表1 不同染鉛濃度對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞ERK活力的影響

2.2 bFGF對不同染鉛濃度大鼠海馬神經(jīng)元ERK活力的影響 預(yù)先用終濃度0.6 μg/L的bFGF處理海馬神經(jīng)細(xì)胞1h后，再加入不同濃度醋酸鉛共同培育30 min，除染鉛組1外各組的ERK活力與沒有經(jīng)過bFGF處理的細(xì)胞相比都有了不同程度的下降。在經(jīng)過bFGF處理的不同染鉛濃度組范圍內(nèi)，其ERK比活力與對照組(bFGF處理但沒有染鉛細(xì)胞組)相比無顯著性差異，如表1所示。

3 討 論

鉛是常見的環(huán)境和工業(yè)污染物，長期暴露在低濃度鉛環(huán)境會影響神經(jīng)傳導(dǎo)的正常功能，也會造成學(xué)習(xí)和記憶障礙[7]，但目前對鉛影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)的機(jī)制還不是非常清楚。最新研究表明，鉛能與鐵競爭性的跟轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，從而影響細(xì)胞內(nèi)鐵平衡，進(jìn)而降低鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein，IRP)的表達(dá)[3]。而IRP是體內(nèi)許多物質(zhì)的調(diào)控因子，可以負(fù)反饋的調(diào)節(jié)ERK的含量[4]。所以，同本實驗觀察的現(xiàn)象一樣，低濃度的醋酸鉛可以調(diào)高ERK的活性，達(dá)到未加鉛時的7.885倍。

bFGF是常見的細(xì)胞生長因子，可以有效的保護(hù)海馬神經(jīng)元，使其免遭損傷。實驗結(jié)果證明，經(jīng)過0.6 μg/L的bFGF處理海馬神經(jīng)細(xì)胞1 h后，在鉛濃度為0.5 μmol/L及以上時與未經(jīng)過bFGF預(yù)處理的染鉛同濃度實驗組相比ERK的活性明顯降低，但是在鉛濃度為0.1 μmol/L時，ERK活力升高明顯，說明bFGF與鉛產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)。而當(dāng)鉛濃度繼續(xù)升高時，ERK活力增長緩慢，處于平臺期，與正常ERK活力接近，說明了bFGF對染鉛海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。但bFGF對神經(jīng)元保護(hù)作用的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，可能跟其影響ERK/MAPK信號途徑有關(guān)。

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