骨髓間充質(zhì)干細胞影響CCl4肝纖維化大鼠的實驗研究

楊志堅

(咸寧市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，湖北 咸寧 437100)

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有向多種細胞分化的能力[1，2]。新近的研究指出，BMSCs可在體外和體內(nèi)分化為肝細胞，BMSCs注射可修復損傷的肝、肺和心臟組織，減少炎癥、膠原沉積[3]。這些結(jié)果提示BMSCs不但可修復損傷組織，還具有減少慢性纖維化的能力[4]。因此，我們將體外培養(yǎng)良好的BMSCs注入以CCl4制備的肝纖維化模型，觀察BMSCs對肝纖維化大鼠模型的干預作用，以期為肝纖維化的治療提供新的治療方向和思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光倒置顯微鏡(Olympus)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，大鼠透明質(zhì)酸(HA)(美國Sigma公司)，四氯化碳(CCl4)(重慶川江化工廠)，免疫組化試劑盒(美國Sigma公司)

1.2 動物分組與模型制備 雌性6周齡SD雄性大鼠，體重140～160g，大鼠隨機分為4組，每組10只：①對照組：1周2次，連續(xù)6周注射蓖麻油(0.2ml/100g)；②CCl4組：1周2次，連續(xù)6周皮下注射CCl4(0.2ml/100g)；③CCl4/BMSCs組：大鼠注射CCl46周后，每只大鼠尾靜脈注射3×106BMSCs；④CCl4/生理鹽水組：大鼠注射CCl46周后，每只大鼠尾靜脈注射等體積的生理鹽水。所有動物購置于武漢大學實驗動物中心，大鼠在無菌條件下飼養(yǎng)，不限進食和飲水。

1.3 BMSCs提取 通過對6周齡的SD雄性大鼠的脛骨和股骨進行沖洗獲取骨髓，隨后在添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過梯度分離法分離出有核細胞后在加入了1%的青霉素-鏈霉素中重懸。細胞在37 ℃，5%濕化的 CO2條件下孵育12～14d。

1.4 CCl4誘導肝纖維化模型的制備及骨髓間充質(zhì)干細胞的注入方法

1.4.1 肝纖維化模型的制備 將CCl4溶解在等體積的蓖麻油中，通過皮下注射至大鼠體內(nèi)，其中CCl4劑量為0.2 ml/100g，濃度為40 ml/L，其中對照組注射等體積的蓖麻油。

1.4.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的注入方法 BMSCs對肝纖維化大鼠的干預：CCl4注射6周后，每只大鼠注射3×106細胞數(shù)[5]BMSCs。

1.5 檢測指標與方法 以顯微鏡觀察肝組織形態(tài)學改變、比色法分析羥脯氨酸含量[5]、采用標準實驗室方法檢測血清氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和白蛋白。

1.6 統(tǒng)計分析方法 以SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示，組間采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝纖維化的評定 CCl4組大鼠與對照組相比，血清白蛋白明顯降低(P<0.05)，ALT水平則明顯上升(P<0.05)，肝組織羥脯氨酸水平則有明顯升高(P<0.05)，見表1。組織學觀察發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)明顯的細胞外基質(zhì)含量的增加，在肝小葉周圍出現(xiàn)很多膠原沉積等肝纖維化特征。

2.2 BMSCs對肝纖維化大鼠的干預影響 經(jīng)過BMSCs處理后的肝纖維化大鼠，BMSCs注射后4周處死動物觀察：與CCl4組大鼠相比，CCl4/ BMSCs組大鼠血清白蛋白含量顯著升高(P<0.05)。羥脯氨酸顯著降低(P<0.05)，而肝臟的ALT則并未有顯著降低(P>0.05)。組織學觀察，骨髓間充質(zhì)干細胞具有明顯的抗纖維能力，CCl4/BMSCs組肝纖維程度顯著降低。

表1 不同組別之間肝功能與羥脯氨酸含量比較

3 討 論

CCl4誘導的大鼠常常被用來作為肝纖維化的實驗模型予以研究。CCl4可產(chǎn)生自由基,通過脂質(zhì)過氧化反應引起持續(xù)性肝臟損傷[6]。在本實驗中，當大鼠每周給予CCl42次，連續(xù)6周后，肝纖維化明顯，模型制備成功。

Xiang等[7]發(fā)現(xiàn)CCl4誘導的肝組織損傷大鼠中，注射BMSCs可定向遷移到損傷部位而不依賴于BMSCs注射部位。BMSCs修復纖維化的過程仍不清楚，Ortiz等[8]發(fā)現(xiàn)盡管干細胞生成的干細胞形成的白蛋白在CCl4誘導的肝組織中低頻率的表達，BMSCs與Flk1的融合可減輕細胞纖維化。盡管目前很少的研究能說明BMSCs移植到肝臟中的數(shù)量和質(zhì)量，但BMSCs在損傷肝臟中的抗纖維化作用是確定的。

我們運用起源于健康雄性SD大鼠的BMSCs注射至CCl4誘導的雌性肝纖維化大鼠體內(nèi)。組織的檢查發(fā)現(xiàn)肝臟纖維化水平明顯降低，羥脯氨酸的含量明顯降低。肝功能也通過BMSCs的治療得以明顯改善。這些結(jié)果說明，注入同種異體的BMSCs對臨床肝纖維化的治療具有很大的價值。我們推測BMSCs可能通過改善移植肝臟部位的微環(huán)境而對CCl4誘導的損傷發(fā)揮保護作用。BMSCs分泌的很多細胞因子，如：肝臟生長因子具有抗凋亡的作用且在肝臟的再生過程中發(fā)揮重要作用[9，10]本實驗的研究結(jié)果說明了骨髓間充質(zhì)干細胞在肝纖維化防治過程中的重要作用，但其機制需進一步的研究。

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