連翹苷與牛血清白蛋白的相互作用

張玉霖，陳 莉

(湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100)

連翹苷是存在于連翹葉和果實里的一種活性物質,具有清熱、解毒、散結排膿等功效，主治溫熱、瘡瘍、瘰疬、丹毒、班疹、流感，還有降血脂、抗氧化等功效[1]，是多種藥物制劑的主要成分，但其作用機理少見報道。血清白蛋白是血漿中含量最為豐富的蛋白質，其結構簡單,可與許多內源性或者外源性化合物相互作用，并對這些物質在生物體內的存儲與轉運發揮著重要作用[2]。牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白(HSA)的結構高度相似，而BSA的價格更便宜，因此人們常常研究藥物與BSA的結合情況，作為藥物與HSA結合情況的一種參考[3～6]。研究藥物與蛋白質的結合特性對藥物分子設計、藥物劑型設計、指導臨床用藥以及探索藥物作用機理和了解藥物動力學過程都有非常重要的指導意義。因此，我們采用熒光光譜法研究連翹苷與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，以了解它們之間的結合特性。

1 材料與方法

1.1 材料 RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司)；PHS-3C型PH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)；FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；連翹苷(四川省維克奇生物科技有限公司，批號110926,純度≥98%)；牛血清白蛋白(BSA，中國科學院化學研究所)；Tris堿(三羥甲基氨基甲烷，上海伯奧生物科技有限公司)；其他試劑為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 方法 取連翹苷用適量甲醇溶解后，以二次蒸餾水配制成濃度約為2g/L 的溶液，稱取兩份BSA分別溶于302K、310K溫度下pH=7.4的Tris-Hcl緩沖溶液，配制成1×10-5mol/L的BSA溶液；在1cm比色皿中加入2ml的BSA溶液(1×10-5mol/L)，每次加入連翹苷(濃度約為2g/L)2μl，分別在302K、310K溫度(每次保溫5min)下， 282nm為激發波長，激發和發射狹縫寬度分別為10nm、5nm，于300～500nm范圍內掃描熒光光譜。

2 結 果

2.1 連翹苷對BSA熒光的猝滅作用 研究發現，在激發波長為282nm時，BSA的最大熒光發射波長為348nm，隨著連翹苷濃度的不斷增加，BSA在348nm處的熒光強度逐漸減弱，呈現典型的熒光猝滅現象，并且隨著連翹苷濃度的增加，BSA的最大熒光發射波長逐漸減小，都表明兩者之間發生了相互作用，連翹苷對BSA的熒光有猝滅作用。

通常，熒光猝滅符合Stem-Volmer方程[7,8]：F0/F=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q](其中，F0、F分別為無、有猝滅劑時BSA的熒光強度值；[Q] 為猝滅劑的濃度；Ksv為熒光猝滅常數；kq為熒光猝滅速率常數。τ0為沒有猝滅劑時熒光物質分子的平均壽命，一般情況下，生物大分子的平均熒光壽命約為10-8s；)。根據Stern-Volmer方程，以F0/F-1對所加入的連翹苷溶液的濃度C作圖(見圖1)。求得302K,310K時的線性回歸方程、相關系數及Ksv值和kq值見表1。

圖1 連翹苷對BSA在302K、310K下的Stern-Volmer曲線

表1 連翹苷對BSA的Stern-Volmer曲線方程、Ksv值及kq值

溫度/K 方程 Ksv(L/mol) kq[L/(mol·s)] 相關系數302 F0/F-1=0.000479+12654.1 C 12654.1 1.26541×1012 0.99859310 F0/F-1=-0.0136+12419.6 C 12419.6 1.24196×1012 0.99869

2.2 結合常數Ka和結合位點數n的計算 生物大分子與藥物小分子相互作用的結合常數Ka、結合位點數n和猝滅劑濃度C之間滿足方程： 1g(F0/F-1=1gKa+n1gc(其中，Ka為藥物與BSA相互作用的結合常數，n為結合位點數。)以lg(F0/F-1)對lgC作圖得到直線，見圖2；由直線截距和斜率可求出連翹苷與BSA的結合常數Ka及結合位點數，見表2。

圖2 302K,310K下連翹苷對BSA的lg(F0/F-1)～lgC曲線

表2 連翹苷對BSA的lg(F0/F-1)～lgC的線性方程、結合常數Ka和結合位點數n

溫度/K 方程 lgKa Ka( L/mol) n R302 lg(F0/F-1)=3.827+0.9410 lgC 3.827 103.827 0.9410 0.9974310 lg(F0/F-1)=4.249+1.0395 lgC 4.249 104.249 1.0395 0.9968平均值 ～10000 0.9903 0.9971

3 討 論

由掃描所得的光譜圖可知，固定BSA濃度的情況下，隨著連翹苷濃度的增加，BSA的熒光強度逐步減弱，表明連翹苷與BSA之間發生了相互作用。通常情況下認為，各種熒光猝滅劑對生物大分子的動態熒光猝滅速率常數的最大值約為2.0×1010L/(mol·s)[9]；本研究表明：302K、310K時連翹苷對BSA的熒光猝滅速率常數kq分別為1.26541×1012，1.24196×1012L/(mol·s)，均大于2.0×1010L/(mol·s)；且隨著溫度的升高，連翹苷對BSA的猝滅常數降低，均表明連翹苷對BSA熒光的猝滅屬靜態猝滅。且連翹苷與BSA的作用位點數n的平均值為0.9903,表明兩者之間形成了一個結合位點。隨著溫度的升高，結合常數逐漸升高，這可能是由于溫度的升高使藥物小分子和蛋白分子之間的分子擴散和碰撞增強，從而導致了結合常數的增加。

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