高效液相色譜法測(cè)定阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)

劉振宇

摘 要：采用高效液相色譜法對(duì)阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為0.05mol/L檸檬酸溶液（用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.0）-乙腈-四氫呋喃（53：27：20），檢測(cè)波長為244nm，柱溫為35℃，流速為1.5mL/min。結(jié)果表明，在所建立的色譜條件下，阿托伐他汀鈣與各雜質(zhì)分離良好，所建立的方法專屬性、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性均較好，可用于阿托伐他汀鈣片有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：阿托伐他汀鈣片；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

心血管疾病是危害人類健康（特別是中老年）最常見、最嚴(yán)重的疾病之一，血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病以及其他心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。阿托伐他汀通過抑制肝臟內(nèi)HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成從而降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平，并通過增加細(xì)胞表面的肝臟LDL受體以增強(qiáng)LDL的攝取和代謝。醫(yī)學(xué)界公認(rèn)比天然微生物發(fā)酵、半合成的他汀類藥物好，患者使用時(shí)，起始劑量即有優(yōu)異的調(diào)脂達(dá)標(biāo)率。文章建立了以0.05mol/L檸檬酸溶液（用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.0）-乙腈-四氫呋喃（53：27：20）為流動(dòng)相的HPLC分析方法，用于對(duì)阿托伐他汀鈣的測(cè)定[1-2]。該方法專屬性良好，而且方法方便、快速、準(zhǔn)確。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Hitachi Chromaster-5430檢測(cè)器，Hitachi Chromaster-5310柱溫箱，Hitachi Chromaster-5210自動(dòng)進(jìn)樣器，Hitachi Chromaster-5110泵），Chromaster色譜工作站，日本Hitachi公司；十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（250mm×4.0mm，5μm），美國Thermo公司； AR1140電子天平，美國Ohaus公司。

1.2 試劑

阿托伐他汀鈣對(duì)照品（中國藥品生物制品鑒定所）；阿托伐他汀鈣雜質(zhì)A、C、F、H對(duì)照品（USP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)）；乙腈、四氫呋喃為色譜純?cè)噭?其余試劑為市售分析純?cè)噭凰疄榧儍羲?/p>

2 方法

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05mol/L檸檬酸溶液（用氨水調(diào)節(jié)pH值至4.0）-乙腈-四氫呋喃（53：27：20）；流速：1.5ml/min；檢測(cè)波長：244nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl。理論塔板數(shù)按阿托伐他汀峰和阿托伐他汀鈣雜質(zhì)C峰計(jì)應(yīng)不低于5000和7000，兩峰的拖尾因子分別不得過1.5，兩峰之間的分離度應(yīng)不小于1.5。溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，阿托伐他汀峰和阿托伐他汀鈣雜質(zhì)C峰的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)分別不得過1.0%和2.0%。

2.2 溶液配制

阿托伐他汀鈣對(duì)照品溶液：取阿托伐他汀鈣對(duì)照品10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加混合溶劑[（0.05mol/L檸檬酸銨溶液（用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.4）-乙腈（50：50）]適量，充分振搖使溶解后，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻即得。阿托伐他汀鈣供試品溶液：取阿托伐他汀鈣片20片，研細(xì)，精密稱取粉末適量（約相當(dāng)于阿托伐他汀10mg），置100ml量瓶中，加混合溶劑適量，充分振搖使溶解后，用混合溶劑稀釋至刻度，搖勻即得。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn)

取阿托伐他汀對(duì)照品與雜質(zhì)對(duì)照品適量，精密稱定，配成含阿托伐他汀100μg/ml與各個(gè)雜質(zhì)10μg/ml的混合溶液， 進(jìn)樣， 阿托伐他汀與各雜質(zhì)間分離良好。取阿托伐他汀對(duì)照品約10mg，精密稱定，置100ml量瓶中，對(duì)阿托伐他汀分別進(jìn)行酸、堿、氧化、熱及光照破壞試驗(yàn)， 分別加入1mol/L鹽酸適量，1mol/L氫氧化鈉適量，30%雙氧水適量，冷卻到室溫，調(diào)節(jié)pH至中性，直火燒至熔融，在4500lx光照條件暴露24h后，用稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液20μl進(jìn)樣，記錄色譜圖。阿托伐他汀在不同條件下均有不同程度的降解，主成分峰與降解雜質(zhì)峰分離良好。

3.2 線性相關(guān)性試驗(yàn)

精密稱取阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H對(duì)照品適量，加混合溶劑稀釋，配制成濃度約為1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取各標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H分別在濃度范圍1.05-4.20μg/ml、1.04-4.16μg/ml、1.13-4.52μg/ml、1.11-4.44μg/ml內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性。

3.3 儀器精密度試驗(yàn)

精密稱取阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H對(duì)照品，加入混合溶劑稀釋，使?jié)舛确謩e約為1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml，分別配6個(gè)樣，精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。RSD分別為1.12%、0.83%、0.99%、1.32%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4 定量限和檢測(cè)限試驗(yàn)

精密稱取阿托伐他汀鈣各雜質(zhì)F、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)H對(duì)照品適量，用混合溶劑逐步稀釋，精密量取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)信噪比為10：1時(shí)，即為定量限；當(dāng)信噪比為3：1時(shí)，即為檢測(cè)限。雜質(zhì)F、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)H的定量限分別為0.40μg/ml、0.40μg/ml、0.40μg/ml、0.40μg/ml，雜質(zhì)F、雜質(zhì)A、雜質(zhì)C、雜質(zhì)H的檢測(cè)限分別為0.15μg/ml、0.15μg/ml、0.15μg/ml、0.15μg/ml。

3.5 回收率試驗(yàn)

配制阿托伐他汀鈣片溶液（阿托伐他汀約濃度為500μg/ml），精密稀釋阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H對(duì)照品貯備液做為阿托伐他汀鈣雜質(zhì)溶液，分別取阿托伐他汀鈣片樣品溶液、雜質(zhì)溶液各一份混勻，配制成低、中、高三個(gè)濃度，濾過，作為樣品溶液Ⅱ；另取阿托伐他汀鈣片溶液適量，加混合溶劑稀釋成每1ml中約含100μg的溶液，濾過，取續(xù)濾液，作為樣品溶液Ⅰ，精密稱取阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H對(duì)照品適量，加入混合溶劑稀釋，使?jié)舛燃s為1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml作為對(duì)照品溶液；分別取上述各溶液20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定回收率。計(jì)算雜質(zhì)F、A、C、H的回收率，平均回收率分別為100.2%、99.7%、101.3%、100.5%，RSD分別為0.87%、0.93%、1.56%、1.33%。

3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取阿托伐他汀鈣雜質(zhì)F、A、C、H對(duì)照品適量，加入混合溶劑稀釋，使?jié)舛确謩e約為1.5μg/ml、1.5μg/ml、1.5μg/ml、0.5μg/ml的對(duì)照溶液，于室溫、陽光不直射的情況下放置，分別于2、4、8、10、12、18、24小時(shí)取樣，精密吸取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算變化率均在5.0%以內(nèi)。結(jié)果表明樣品溶液在室溫條件下放置24h穩(wěn)定。

3.7 耐用性試驗(yàn)

采用不同品牌色譜柱，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，調(diào)節(jié)水相和有機(jī)相比例，調(diào)節(jié)柱溫，調(diào)節(jié)流速，進(jìn)行樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定。結(jié)果表明，符合系統(tǒng)適用性要求，色譜柱、流動(dòng)相pH、流動(dòng)相比例、柱溫、流速的微小調(diào)整，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較小，方法耐用性良好。

參考文獻(xiàn)

[1]S. V. Londhe， R. S. Deshmukh， S. V. Mulgund， K. S. Jain. Development and validation of a reversed-phase HPLC method for simultaneous determination of aspirin， atorvastatin calcium and clopidogrel bisulphate in capsules. Indian J Pharm Sci. 2011，73（1）： 23-29.

[2]Bahia A. Moussa， Asmaa A. El-Zaher， Marianne A. Mahrouse， and Maha S. Ahmed. Simultaneous determination of amlodipine besylate and atorvastatin calcium in binary mixture by spectrofluorimetry and HPLC coupled with fluorescence detection. Anal Chem Insights. 2013， 8： 107-115.