肺表面活性物質蛋白 B參與新生兒呼吸窘迫綜合征發病可能機制的探討

陸 芬 （山東省郯城縣第一人民醫院新生兒科，山東郯城 276100）

·臨床與轉化醫學·

肺表面活性物質蛋白 B參與新生兒呼吸窘迫綜合征發病可能機制的探討

陸 芬 （山東省郯城縣第一人民醫院新生兒科，山東郯城 276100）

目的：探討肺表面活性物質蛋白 B（SP-B）參與新生兒呼吸窘迫綜合征（RDS）發病的可能機制．方法：選取我院2011-09／2013-09收治的63例因 RDS死亡且無血緣關系的新生兒為 RDS組，分為32周以下組、32～36周組及36周以上組，每組各21例；選取我院收治的63例無血緣關系的非 RDS而死亡的新生兒為對照組，分組方式與 RDS組以 1∶1相對應．結果：RDS組中，肺部表面活性物質蛋白B（SP-B）mRNA陽性的細胞數量隨胎齡增加保持不變，而對照組中，肺部表面活性物質蛋白 B（SP-B）mRNA陽性的細胞數量隨胎齡增加而升高．RDS組肺部表面活性物質蛋白 B（SP-B）mRNA陽性的細胞數水平顯著小于對照組．RDS組肺表面活性物質蛋白SP-B缺陷頻率為14．29%，明顯大于對照組（1．59%）；RDS組肺表面活性物質蛋白 SP-BmRNA缺陷頻率42．86%，也明顯大于對照組7．94%．結論：SP-BmRNA的缺失也是引發 RDS病的因素之一．

呼吸窘迫綜合征；新生兒；肺表面活性物質蛋白 B

0 引言

引發新生兒呼吸系統衰竭的常見病癥之一就是新生兒呼吸窘迫綜合征（NRDS），這種疾病也正是新生兒尤其是早產兒最致命的死亡病因．NRDS病發的關鍵機理在于因為新生兒機體內部缺少相關的肺泡表面活性物質（pulmonary surfactant，PS），從而使得機體肺泡的表面作用力變大，大量的肺泡出現塌癥狀．肺泡表面活性物質是由上皮細胞分泌的一種復雜的磷脂蛋白，它的主要功能就是對維護新生兒肺部呼吸能力并且使得肺泡的表層張力減小．從目前的研究結果可以看出，SP肺表面活性蛋白-B抗體的缺失與Respiratory Distress Syndrome（RDS）的發生息息相關［1］，然而上位基因的序列往往會調節控制蛋白的表達情況．本論文的目的主要是研究 SP肺表面活性蛋白-B抗體的異常與 RDS的發生情況的相關性，我們從基因以及蛋白兩方面的標準選擇我院從 2011-09／2013-09兩年之內在新生兒監護病房（neonatal intensive care unit，NICU）治療的死亡的 RDS病患，并分析研究其 SP-B的狀況．

1 資料和方法

1．1 一般資料 選取我院 2011-09／2013-09入院的由于 RDS致死的新生兒病例 63例，命名為 RDS組，隨后選取的對照組則為同一時期由于其他因素致死的63例新生的嬰兒，其中死亡因素有肺部支氣管先天發育不全、休克以及先天性心臟病等病癥，以此同時，這些病例都與RDS組的各個方面相似，比如性別、重量、年齡、孕婦的生產時間以及分娩的手段等很多條件．

RDS組與對照組依照次序的先后，每組分別有21例病患，并將其歸入胎齡小于等于 31周、胎齡為32～36周之間和胎齡大于等于 37周，并且符合患兒與患兒之間沒有任何血緣關系的要求，家屬知情同意尸檢．

1．2 方法

1．2．1 肺組織取材 對研究的所需死亡的患兒均將其肺組織取出，時間限制在其死亡后的30 min之內．RDS組分別在死亡患兒的五葉肺部位切取肺部組織一小塊，而在對照組的死亡病患隨機的在肺部切取肺組織的其中一小塊．在切取肺組織后的研究所需死亡的患兒應當將其馬上浸沒在多聚甲醛（4%）溶液中使其固化，再用石蠟包裹掩埋之后，連續切片 5 μm．

1．2．2 免疫印跡分析 SP-B蛋白在肺部的表達 肺組織將被研磨成碎片，與裂解緩沖液配制成1∶5的比例，在4℃的溫度下，離心機中以12 000 r／min的轉速離心1 h，將 SDS凝膠置于10 L的上清液并加入緩沖液然后對 SDS凝膠進行電泳實驗，完成電泳步驟之后將其轉移到了硝酸纖維素的薄膜之上，隨后再用Tris-HCl緩沖溶液（TBS）Tween20進行洗滌，在3%濃度的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）中封閉一小時，3%BSA與兔抗人SP-B多克隆抗體按照1 ∶3 000的比例進行稀釋，隨后酸纖維素膜將會被放置在溶液中，在 4℃的條件下放置過夜，將硝酸纖維素膜置于搖床上1×TBST的溶液中振動洗滌三次，堿性磷酸酶標示過的二抗性羊抗兔蛋白 IgG與TBST依據1∶5 000的比例進行稀釋，與此同時，硝酸纖維素膜將會被置于內部，在室溫條件下放置2 h，搖床均勻振動．

1．2．3 SP-BmRNA陽性細胞表示的定性以及定量準則 黃色顯色劑二氨基聯苯胺 DAB液著色之后，若有棕黃色的顆粒出現在胞漿中，則說明表達出的信號為雜交陽性，如果細胞的胞漿被著色染成棕黃的顏色則診斷其為 SP-BmRNA表現為陽性，隨后采用四百倍的放大顯微鏡計算細胞的數量，每個大網格為1個視野，其是由一百個小格子構成．

1．2．4 SP-BmRNA缺失個體調查 SP-BmRNA相對標示量標準下限等于平均值減去兩倍的標準偏差（x－2s），而 SP-BmRNA相對標示量比對照組標準下限的個體值更低，將其診斷為缺失SP-BmRNA．

1．3 統計學處理 使用 SPSS 13．0統計學軟件分析患者資料，采用 t檢驗比較計數的資料，并以±s表示；兩組內部的比較利用單因素方差進行研究，SP-B蛋白的缺失之間的比較應用配對四格表χ2進行統計，P＜0．05認為差異具有統計學意義．

2 結果

2．1 臨床資料 患有RDS的新生兒在出生以后的0．5～6 h病發，臨床癥狀表現為進行性持續的呼吸困難癥狀，血氣數值顯示出低氧血與高碳酸血癥，診斷胸片確定為 III級和 IV級的呼吸窘迫綜合征，在住院期間患兒采用豬肺磷脂一次又一次復診，給藥量為每次200 mg／kg，每天用藥3～4次，都需要頻率比較高的振動伴隨著機械性的接通氣體，患兒由于生病致使死亡或者由于經濟拮據從而放棄對新生兒進行治療，在出生后的兩周之間死亡的 RDS患兒病癥為 IV級者，大多數患兒在7 d之內由于患病而導致自然死亡．

2．2 肺部 SP-BmRNA表示陽性細胞的類比分析SP-BmRNA在對照組表示出的陽性細胞數（53．28± 10．74）要遠遠大于 RDS組（33．11±14．85），說明RDS組減小顯著，差異具有統計學意義；而RDS組組中比較，胎齡增大，SP-BmRNA在肺部陽性細胞數表示沒有隨之而增多，然而相對于對照組，在胎齡增大情況下，肺部SP-BmRNA表達陽性的細胞數量隨之顯著增多．對于大于或者等于 32周的亞組，mRNA表示陽性細胞的數量，RDS組明顯小于對照組；而在32～36周的亞組中，RDS組細胞數仍然小于對照組的細胞數量；在大于或者等于37周的亞組比較中，RDS組的細胞數量相對對照組顯著減少．表 1為肺部SP-BmRNA陽性表達細胞數量在組間和組內以及亞組之間的比較．

表1 肺部SP-B mRNA陽性表達細胞子在組間以及組內亞組之間的比較

2．3 蛋白 SP-B以及 SP-BmRNA相對表示呈現的趨勢 蛋白 SP-B在 RDS組缺失幾率為14．29%，顯著高于對照組的 1．59%，差異有統計學意義（P＜0．05），RDS組SP-BmRNA缺陷頻率為42．86%，也顯著高于對照組的7．94%．

3 討論

過去的研究表明，呼吸窘迫綜合征主要在早產兒身上發生，然而在新生兒診療技術越來越發達的當今，RDS的發生幾率在足月兒身上也是逐年增高．近幾年，世界頂尖研究以及相關的臨床病癥顯示，多基因和許多復雜的原因是 RDS發病的主要因素，然而基因控制調節在 RDS的發病機理中可能占據了重要的功效．雖然 PS的混合物中 SP-B蛋白只是僅僅占了其中1%～2%的量，但是 SP-B蛋白仍然是確保正常呼吸的肺表面活性劑功效中最為重要的肺表面活性蛋白質，蛋白SP-B使得表面活性物質能在肺泡的氣液介質上面快速伸展以及加快深入表面單獨每一層的速率和確保表面活性物質功效的實施，使肺泡表面的作用力逐漸減小，從而防止肺泡的坍塌．與此同時，蛋白 SP-B還是構成肺和形成管狀骨髓必須具備的一部分，構成這些部分必須有SP-C的加入．最近的調查顯示，SP-B蛋白的基因遺傳和 RDS在新生兒患者中阻塞性慢性肺氣腫等病癥息息相關，而且目前國內的研究已經逐漸開展并且也已經取得了初步良好的效果［2］，但蛋白 SP-B降低的發病因素我們還尚未研究清楚．人們對SP-B基因缺失越來越表現出理解的態度，并且渴望為新生兒相關病例的臨床診療和治愈開辟更加廣闊的學術新天地．

［1］尹曉娟，李麗華，王 艷，等．新生兒呼吸窘迫綜合征患兒肺表面活性物質蛋白B表達的研究［J］．中國新生兒科雜志，2011，26：336－339．

［2］尹曉娟，謝 露，池 婧，等．SP-B遺傳缺陷導致足月新生兒呼吸窘迫綜合征3例［J］．中國新生兒科雜志，2011，26（4）：268．

The study of possible mechanism of surfactant protein B participate in neonatal respiratory distress syndrome

LU Fen
Department of Neonatology，First People's Hospital of Tancheng，Tancheng 276100，China

AIM：To explore the possible mechanism of the lung surface active substance protein B（SP-B）in neonatal respiratory distress syndrome（RDS）．METHODS：Selected from September 2011 to September 2013，63 cases of unrelated newborns dying of RDS were set as RDS group，of which there were 31 weeks or less group，32～36 weeks group and 37 weeks or more group，21 cases in each group；63 cases of newborn，unrelated，death from other diseases，were set as the control group，to match the gestational age with the RDS group at 1∶1．RESULTS：RDS group，lung SP-BmRNA positive cells number did not increase with the increase of gestational age，whereas the control lung SPBmRNA positive cells number increased with the increase of gestational age．SP-BmRNA positive expression cells in RDS group were obviously lower than the control group．Defect frequency of B protein in RDS group was 14．29%，significantly higher than the control group's 1．59%；RDS group's SP-BmRNA defect frequency was 42．86%，which was also significantly higher than the control group's 7．94%．CONCLUSION：SP-BmRNA defects involved in the pathogenesis of RDS．

respiratory distress syndrome；newborn；lung surface active substances protein B

2095-6894（2014）05-035-03

2014-05-22；接受日期2014-06-09

陸 芬．本科，副主任醫師．研究方向：新生兒．Email：liuyilei88888＠163．com

R722．1

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