多種腫瘤標志物在肺腺癌中的表達及預后意義的研究

楊欣 薛麗燕 郭蕾 溫芃 林冬梅

腺癌作為最常見的肺癌組織學類型，在全球及我國發病率均呈上升趨勢[1]。流行病學研究結果顯示，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發病有明顯的性別差異，尤其是腺癌。腺癌占女性原發肺癌的75%，是年輕非吸煙患者的主要組織學類型[2,3]，近年與腺癌表達及預后相關標記物的研究已成為熱點。本研究中采用免疫組化方法，檢測一組標記物在肺腺癌組織中表達情況，分析其表達與臨床病理特征和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2003年1月-2006年12月中國醫學科學院腫瘤醫院手術切除（腫瘤及其所在肺葉+區域淋巴結清掃）且隨訪資料完整，明確診斷肺腺癌的患者227例?；颊咝g前均未行放、化療。肺癌腫瘤組織經常規甲醛固定、石蠟包埋。按照第7版美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer, AJCC）腫瘤分期標準進行TNM分期。記錄患者性別、年齡、吸煙史、分期、分化程度、術后治療（包括化療、放療及靶向治療）及隨訪情況等。將吸煙史按照吸煙（包括當前吸煙——正吸煙或戒煙＜12個月和既往吸煙——一生累積吸煙量＞100支，肺癌確診前戒煙＞12個月）和非吸煙（從未吸煙或一生累積吸煙量＜100支）進行分組分析。

1.2 材料 組織芯片儀采用Tissue Microarrayer，美國Beecher Instruments公司產品。一抗來源：小鼠單克隆抗體Napsin，Abcam公司產品，原液1:100稀釋；小鼠單克隆抗體TTF-1、兔單克隆抗體ERα、兔多克隆抗體ERβ、小鼠單克隆抗體PR、小鼠單克隆抗體Bcl-2及兔多克隆抗體RRM1，北京中杉生物技術公司，工作液；小鼠單克隆抗體HER2及小鼠單克隆抗EGFR野生型抗體，Dako公司，工作液；小鼠單克隆抗體ERCC1，福州邁新生物技術公司產品，工作液。二抗來源：Ventana即用型抗體。

1.3 方法

1.3.1 組織芯片（tissue microarray, TMA）的構建 選取并標記HE切片上具有代表性的腫瘤區域及相應蠟塊。將所需的靶組織（每例選取2個腫瘤組織芯）用直徑1.0 mm的吸針從供體蠟塊靶區取出，按芯片設計的排列順序定位裝載在受體蠟塊中。受體蠟塊連續4 μm切片備用。

1.3.2 免疫組化染色 白片經70oC烤箱烤至少1 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化至蒸餾水后行抗原修復，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0，Napsin A、ERα、ERβ、PR、HER2、EGFR、ERCC1）或1 mM EDTA（pH=9.0，TTF-1、RRM1）高壓抗原修復2.0 min。一抗室溫孵育1 h，通用型二抗室溫孵育15 min，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染。

1.3.3 免疫組化染色結果判定 （1）陽性染色定位：TTF-1、ERα、ERβ、PR 、ERCC1陽性染色定位于細胞核，HER2為細胞膜，EGFR為細胞膜和（或）細胞漿，Bcl-2、RRM1為細胞漿。（2）評分標準：①Napsin A、TTF-1、EGFR、Bcl-2、ERCC1、RRM1：（-）無腫瘤細胞著色，（1+）為淺黃色，（2+）為棕黃色，（3+）為黑棕色。③ERα、ERβ、PR：（-）無腫瘤細胞著色或著色腫瘤細胞數＜5%，（1+）著色細胞數為5%-25%，（2+）著色細胞數26%-50%，（3+）著色細胞數＞50%。④HER2：（-）無著色，（1+）任何比例的癌細胞呈現微弱、不完整的細胞膜著色，（2+）＞10%的癌細胞呈現弱至中等強度、完整但不均勻的細胞膜棕黃著色或＜30%的浸潤癌細胞呈現強且完整的細胞膜棕褐著色，（3+）＞30%的癌細胞呈現強的、完整的細胞膜棕褐著色。同一例兩個組織芯片染色不一致時以高評分為準。由2名病理醫師分別閱片，結果一致者為最后判定結果。HER2蛋白染色結果以2+及以上定義為陽性組（+）進行結果分析，其他9種蛋白以1+及以上定義為陽性組（+）進行結果分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計分析。采用χ2檢驗比較不同臨床病理特征病例的癌組織中各蛋白表達差異，采用Kaplan-Meier方法進行單因素生存分析，Cox回歸進行多因素生存分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基于組織芯片技術的免疫組化檢測有效率 組織芯片制作過程中常出現脫靶（所取靶區腫瘤組織連續切片后消失）及免疫組化染色操作過程中組織樣品脫片現象，本研究中10種標記物檢測有效率為91.2%-95.6%（表1）。

2.2 臨床病理特征和預后 男性137例，女性90例，男女比例為1.52:1。中位年齡61歲。223例患者有吸煙史資料，吸煙者96例，非吸煙者127例。病理分期為I期145例，II期33例，III期45例，IV期4例。分化程度為高分化39例，中分化109例，低分化79例。術后行輔助治療34例（I期8例：單化療5例，放、化療1例，靶向治療1例，治療方式不詳1例；II期、III期、IV期共26例：單放療3例，單化療13例，放、化療10例），5年總生存率和5年無病生存率分別為72.8%和65.3%；未行輔助治療193例，5年總生存率和5年無病生存率分別為70.2%和61.8%，術后治療和非治療組之間總生存和無病生存均無明顯差異（P＞0.05）。隨訪時間為3個月-99個月，所有患者的5年總生存率為72.2%，其中I期、II期、III期和IV期患者的5年總生存率分別為88.1%、63.1%、33.3%和0，差異有統計學意義（P＞0.001）。

表 1 10種蛋白在組織芯片中的檢測有效率Tab 1 Testing efficiency of 10 markers on TMA sections

2.3 蛋白在肺腺癌中的表達與患者臨床病理特征的關系 免疫組化方法檢測10種蛋白在肺腺癌組織中的表達情況見圖1。其中僅Napsin A蛋白表達與性別有關（P=0.049）。Napsin A、PR及EGFR蛋白表達與吸煙有關，TTF-1和ERCC1蛋白表達與腫瘤大小有關，Napsin A、TTF-1、ERα和PR蛋白表達與分化程度有關，表達與病理分期有關的是TTF-1、Bcl-2和ERCC1蛋白（P＜0.05）。未觀察到上述蛋白表達與患者年齡有關，ERβ、HER2和RRM1蛋白表達與性別、年齡、吸煙、腫瘤大小、分化程度及病理分期均無關性（P＞0.05）（表2）。

2.4 生存分析 單因素生存分析評估臨床病理特征與預后關系，其中腫瘤大小、分化程度和病理分期與總生存（overall survival, OS）和無病生存（disease-free survival,DFS）有關（P＜0.05）（表3）；單因素生存分析 10種蛋白在腫瘤組織中表達與預后：Napsin A、TTF-1和ERCC1蛋白表達與OS有關（圖2A-圖2C）；TTF-1蛋白表達與患者DFS有關（圖2D）（P＜0.05）（表4）。進一步對I期患者進行分析，僅Napsin A蛋白表達與I期患者OS有關（圖2E）（P＜0.05）。未觀察到表達與I期患者無病生存有關的蛋白（P＞0.05）（表5）。多因素生存分析，僅病理分期是患者總生存和無病生存相關的預后因素（P＜0.05），未發現表達與患者預后相關的蛋白（P＞0.05）（表6）。

3 討論

目前TNM分期是評估肺癌預后最重要的指標，但相同分期患者預后存在顯著差別，即使根治性切除的I期肺腺癌病例，5年復發率也有40%[4]。因此，尋找可以提示預后的分子病理標志物是肺癌研究亟待解決的問題。

TTF-1和Napsin A作為肺腺癌敏感性及特異性均較好的標記物，臨床最常組合應用于肺腺癌組織學亞型的鑒別診斷中，近年TTF-1還被視作一個潛在的NSCLC預后標記物，高表達者預后好[5,6]。本研究結果顯示TTF-1表達與5年總生存及無病生存均相關，高表達者預后好，與上述文獻報道一致。同時還發現TTF-1蛋白表達與腫瘤大小、分化程度和病理分期相關，在最大徑≤2 cm、高分化和I期患者腫瘤組織中表達率高，而以上3項臨床病理特征均是公認提示預后好的因素，也間接為TTF-1高表達提示患者預后好提供佐證。Napsin A是肺和腎組織中均有表達的天冬氨酸蛋白酶，能夠分離表達于II型肺泡上皮的表面活性蛋白B（SP-B）前體。隨著肺腺癌分子檢測和靶向治療的進展，使NSCLC亞型分類的意義愈發明顯，目前Napsin A在NSCLC鑒別腺癌亞型中的應用較廣泛，然而至今關于Napsin A表達與肺腺癌預后的意義研究較少。本研究發現Napsin A蛋白表達與性別、吸煙史及腫瘤分化程度有關，女性、非吸煙者及高分化者陽性率高，且不論在所有病期還是I期病例中陽性患者總生存率高于陰性者，結果與Lee等[7]研究一致。

ERα、ERβ及PR是類固醇受體，屬于核受體超家族。雌、孕激素受體不僅存在于乳腺、子宮等雌激素靶器官，近年來的研究[8]表明，在NSCLC和正常肺組織中亦有表達，且表達與特定的臨床病理特征與預后有關。本研究顯示ERα及PR蛋白表達均與腫瘤分化程度有關，分化好者高表達，PR蛋白表達還與吸煙有關，非吸煙者陽性率高，但二者表達均未顯示與預后有關。ERβ蛋白表達既與臨床病理特征無關也未發現有預后提示意義。包括本研究在內，NSCLC或肺腺癌中ERα、ERβ和PR蛋白表達與臨床病理特征及預后關系的相關研究結果尚存爭議[9-12]，可能與實驗設計的選擇偏倚、實驗條件差異及抗體克隆選擇不同有關，也可能與不同研究組免疫組化結果判讀標準差異有關。尚需更多研究探索它們在肺腺癌發生和發展中的意義。

圖1 免疫組化方法檢測10種蛋白在肺腺癌組織中的表達。A：Napsin A（×200）；B：TTF1（×200）；C：ERα（×200）；D：ERβ（×400）；E：PR（×200）；F：Bcl-2（×200）；G：HER2（×400）；H：EGFR（×200）；I：ERCC1（×400）；J：RRM1（×400）。Fig 1 Expression of 10 markers in lung adenocarcinoma analyzed by immunohistochemistry. A: Napsin A (×200); B:TTF1 (×200); C: ERα (×200); D: ERβ (×400); E:PR (×200); F: Bcl-2 (×200); G: HER2 (×400); H:EGFR (×200); I: ERCC1 (×400); J: RRM1 (×400).

表 2 10種蛋白表達及與患者臨床病理特征的關系Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer

表 2 10種蛋白表達及與患者臨床病理特征的關系（續表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 2 10種蛋白表達及與患者臨床病理特征的關系（續表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 2 10種蛋白表達及與患者臨床病理特征的關系（續表）Tab 2 The relationship between expression of 10 tumor biomarkers and clinicopathological characteristics in the patients with lung cancer(continued)

表 3 單因素分析臨床病理特征與5年總生存率和5年無病生存率關系Tab 3 The relationship among the clinicopathologic characteristics, 5-year overall survival (OS) and 5-year disease-free survival (DFS) analyzed by univariate analysis

Bcl-2是一種癌基因，其蛋白產物是細胞凋亡蛋白家族成員之一，分子量25 kDa的線粒體內膜蛋白，表達于一系列淋巴組織增生性疾病和包括肺癌在內的多種非造血系統惡性腫瘤中。Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡，因此認為該蛋白過表達的腫瘤可能會獲得生長優勢。Bcl-2蛋白表達與肺癌臨床病理特征及預后關系研究不多，本研究中Bcl-2蛋白表達與腫瘤分期有關，病期晚者陽性率高，但生存分析未顯示其表達對患者預后有提示意義，結果與Yaren等[13]和Hanaoka等[14]報道一致。

EGFR和HER-2/neu均為表皮生長因子受體家族成員，在細胞信號傳到中發揮重要的作用，是細胞生長、分化及凋亡的重要調節者。該家族包括EGFR（HER1或erbB1）、HER2（neu或erbB2）、HER3（erbB3）及HER4（tyro2或erbB4）。近年肺腺癌治療和預后相關研究最重要的分子事件是EGFR突變，主要集中在外顯子19（A746-A750）缺失突變和外顯子21（L858R）點突變，是晚期肺腺癌一線EGFR-酪氨酸激酶抑制劑治療療效的預測因子[15]。還有研究[16]報道即使接受傳統的化療，EGFR突變陽性的患者也顯示較好的臨床轉歸，因此提示EGFR突變為提示預后好的分子指標。而野生型EGFR蛋白反映EGFR基因擴增狀態，與EGFR突變情況無平行關系，因此EGFR基因突變的預后價值不能代表野生型EGFR蛋白表達與肺腺癌預后的關系。本研究EGFR抗體為抗野生型EGFR基因蛋白，結果顯示其表達與吸煙有關，非吸煙患者陽性率高，但未觀察到野生型EGFR蛋白表達與患者預后相關，提示相對EGFR基因拷貝數的增加，EGFR基因突變對于評估肺腺癌預后可能更有意義。雖然近年來HER-2/neu在乳腺癌中得到廣泛研究，且分別針對基因擴增狀態及蛋白表達情況的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）和免疫組化檢測技術臨床應用均已成熟，但目前在肺癌中HER2蛋白表達情況及預后價值信息較少。一項HER2與肺癌預后關系的薈萃分析[17]中，納入薈萃分析的多數免疫組化方法研究以染色結果2+及以上為HER2蛋白陽性判定值，結論顯示HER2蛋白過表達提示肺癌尤其小細胞肺癌、肺腺癌和早期NSCLC預后不良。本研究以免疫組化染色結果2+及以上定義為HER2陽性組進行統計分析，結果顯示肺腺癌中HER2蛋白表達與各臨床病理因素均無相關性，陽性組與陰性組生存率亦無統計學差異，結果可能受到研究樣本量小、樣本來源單中心及對免疫組化方法檢測的HER2蛋白陽性定義標準等限制，HER2蛋白在肺腺癌中表達陽性判定標準及其對肺腺癌患者的預后意義需進一步研究和探討。

表 4 單因素分析各蛋白表達與5年總生存率和5年無病生存率關系Tab 4 The relationship among the expression of tumor markers, 5-year overall survival (OS) and 5-year disease-free survival (DFS) analyzed by univariate analysis

ERCC1蛋白是核苷酸切除修復通路中高度保守的單鏈DNA核酸內切酶，參與識別和切除DNA加合物，在核苷酸切除修復中起到限速或調節的重要作用。RRM1是核糖核苷酸還原酶的調節單位，參與減少DNA合成和修復需要的核苷酸向脫氧核糖核蛋白的轉化。RRM1還增加10號染色體磷酸酶和張力蛋白缺失，導致腫瘤細胞生長，遷移和轉移潛能降低，是新型化療吉西他濱的重要靶點。近年來有研究[18,19]報道肺癌組織中ERCC1和RRM1蛋白表達與治療反應和患者預后的關系等。2009美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）推薦ERCC1和RRM1蛋白表達與EGFR基因突變一起，作為評估肺癌預后與預測治療的標記物。但最近Friboulet等[20]研究卻發現，多種市售ERCC1抗體不能有效識別同時具備核苷酸切除修復功能和鉑類抵抗的全能型異構體，因此通過免疫組化方法獲得的ERCC1蛋白表達情況，在不同研究或相同病例不同次檢測中的重復性差，導致其預后和預測作用有限。本研究觀察到ERCC1蛋白表達與腫瘤大小和病理分期有關，腫瘤小和早期患者陽性率高，并且表達與預后有關，陽性組5年總生存率明顯高于陰性組，提示ERCC1是提示肺腺癌預后好的標記物，但未多次或選擇不同病例庫驗證。本研究中RRM1蛋白表達與臨床病理特征及預后均無關，推測可

能亦存在抗體與蛋白異構體識別特異性差的問題，另外在免疫組化染色結果判讀中還發現，RRM1抗體的非特異性著色問題較其他抗體明顯，尚需優化技術平臺進一步論證其與臨床預后的關系。

表 6 多因素分析病理特征和蛋白表達與肺腺癌患者預后關系Tab 6 The correlations among clinicopathologic features and tumor marker expression with 5-year overall survival (OS)/5-year disease-free survival (DFS) in the patients with adenocarcinoma analyzed by mutivariate analysis

圖 2 生存曲線。A：全部病例Napsin A蛋白總生存曲線；B：全部病例TTF1蛋白總生存曲線；C：全部病例ERCC1蛋白總生存曲線；D：全部病例TTF1蛋白無病生存曲線；E：I期病例Napsin A蛋白總生存曲線。Fig 2 Survival curves. A: OS curves for Napsin A in all cases; B: OS curves for TTF1 in all cases. C: OS curves for ERCC1 in all cases; D: DFS curves for TTF1 in all cases; E: OS curves for Napsin A in stage I cases.

綜上，免疫組化方法檢測相關標記物表達以評估肺腺癌預后有一定臨床應用價值：TTF-1、Napsin A和ERCC1蛋白可能是提示肺腺癌患者預后較好的標記物。