健脾益肺解毒方對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響※

● 單愛(ài)云 曹 勇 馬玉玲 曾秀娣 劉 敏 王莎莎

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健脾益肺解毒方對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響※

● 單愛(ài)云1曹 勇2▲馬玉玲2曾秀娣2劉 敏2王莎莎2

目的：探討健脾益肺解毒方藥物血清對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞周期的影響。方法：將細(xì)胞分為荷瘤動(dòng)物藥物血清大、中、小劑量組，模型組，順鉑(DDP)組，維拉帕米(VRP)組，大、中、小劑量分別加DDP組和加VRP組。采用血清藥理學(xué)及流式細(xì)胞術(shù)，觀察健脾益肺解毒方藥物血清分別與DDP和VRP合用后，對(duì)A549/DDP細(xì)胞周期的作用。結(jié)果：健脾益肺解毒方藥物血清合用DDP和VRP后能協(xié)同DDP和VRP增加A549/DDP細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞數(shù)，減少S期細(xì)胞比例(P<0.05)。結(jié)論：健脾益肺解毒方藥物血清能協(xié)同DDP和VRP阻滯A549/DDP細(xì)胞于G0/G1期，阻止A549/DDP細(xì)胞DNA的合成，抑制肺癌耐藥細(xì)胞的分裂增殖。

健脾益肺解毒方 細(xì)胞周期 A549/DDP細(xì)胞

健脾益肺解毒法是臨床治療肺癌的常用方法，臨床發(fā)現(xiàn)健脾益肺解毒方藥對(duì)肺癌中晚期和放化療后均有確切的療效，具有減輕化療藥物毒副反應(yīng)、提高臨床療效、改善臨床癥狀、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期作用，尤其對(duì)肺癌化療前后及康復(fù)期配合健脾益肺解毒中藥，療效尤為明顯。并且實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)健脾益肺化瘀方對(duì)動(dòng)物移植性肺癌具有抑瘤和化療協(xié)同增效作用[1]。為了進(jìn)一步明確健脾益肺解毒方對(duì)肺癌的作用，應(yīng)用藥物血清法，觀察由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、仙鶴草等單味中藥免煎顆粒組成的健脾益肺解毒方對(duì)人肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響，以探討健脾益肺解毒方對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料

1.1藥物健脾益肺解毒方免煎顆粒劑(由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、茜草、仙鶴草等單味中藥免煎顆粒劑組成)，深圳三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。用溫蒸餾水配成相當(dāng)于原生藥材2g/ml的濃縮劑，置4℃冰箱備用。順鉑(DDP)，錦州九泰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10mg/瓶，批號(hào)050502；青霉素，哈藥集團(tuán)制藥總廠生產(chǎn)，100萬(wàn)單位/瓶，批號(hào)0101002；鏈霉素，華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，100萬(wàn)單位/瓶，批號(hào)0101002；維拉帕米(VRP)，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，2ml/5mg，批號(hào)4E12001。

1.2動(dòng)物SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.3瘤株Lewis肺癌，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)腫瘤研究所提供；人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP，由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院呼吸病研究所吳國(guó)明教授惠贈(zèng)。

1.4試劑RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，GIBCO；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，GIBCO。

1.5儀器超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；CO2孵箱，Thermo Forma；96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，Corning；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國(guó)BECKMAN-COULTER(貝克曼-庫(kù)爾特)公司；倒置顯微鏡，Nikon；電子天平，F(xiàn)A2004型，Sartorius，德國(guó)。

2 方法

2.1荷瘤動(dòng)物藥物血清制備取健康C57BL/6J小鼠40只，體重18～22g，每鼠右前肢腋部皮下注射0.2ml小鼠Lewis肺癌組織懸液，24h后隨機(jī)分為健脾益肺解毒方大、中、小劑量組和模型空白對(duì)照組，每組10只。健脾益肺解毒方大劑量組、中劑量組、小劑量組分別按30g·kg-1、20g·kg-1、10g·kg-1灌胃給藥(分別為臨床成人日用量的19.0倍、12.8倍和6.4倍)，模型對(duì)照組以等容積的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)10d，末次灌胃1h，腹主動(dòng)脈采血，無(wú)菌分離血清，經(jīng)56℃30min滅活處理后，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇后的人肺腺癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP，接種于50ml培養(yǎng)瓶，加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100IU·ml-1)6ml，置于37℃、飽和濕度含5%CO2和95%空氣的CO2孵箱中無(wú)菌培養(yǎng)，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)液。

2.3細(xì)胞懸液的制備取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞，加入適量的0.25%胰蛋白酶液消化，PBS洗滌2次，離心，棄上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液配制成2×105·ml-1細(xì)胞懸液。

2.4肺癌耐藥細(xì)胞周期測(cè)定采用流式細(xì)胞術(shù)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549/DDP細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，以2×105·ml-1的量接種于培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2培養(yǎng)24h，至細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛貼壁后，去掉培養(yǎng)液，換成不含胎牛血清的培養(yǎng)液。而后將細(xì)胞分為荷瘤動(dòng)物藥物血清大劑量組(簡(jiǎn)稱大劑量組)，荷瘤動(dòng)物藥物血清中劑量組(簡(jiǎn)稱中劑量組)，荷瘤動(dòng)物藥物血清小劑量組(簡(jiǎn)稱小劑量組)，荷瘤動(dòng)物模型血清組(簡(jiǎn)稱模型組)，A549/DDP組(DDP組)，維拉帕米(VRP)組，大、中、小劑量分別加DDP組和大、中、小劑量分別加VRP組。大、中、小劑量組分別加入300μl終濃度為10%的不同劑量組含中藥荷瘤動(dòng)物血清；模型組加入終濃度為10%的荷瘤動(dòng)物模型血清300μl；DDP組只加入終濃度為1μg·ml-1的DDP 300μl；大、中、小劑量分別加DDP組，同時(shí)加入300μl終濃度10%的不同劑量組含中藥荷瘤動(dòng)物血清和恒定濃度為1μg·ml-1的DDP各300μl；VRP組只加入終濃度為10μg·ml-1的VRP300μl；大、中、小劑量分別加VRP組，同時(shí)加入300μl終濃度10%的不同劑量組含中藥荷瘤動(dòng)物血清和恒定濃度為10μg·ml-1的VRP各300μl；每瓶終體積為3ml，不足部分加以RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，然后分別離心，用PBS洗滌2次，制成細(xì)胞懸液。

收集不同因素處理的106個(gè)細(xì)胞，離心后PBS液洗滌，加入冰冷的70%乙醇固定，PBS液洗滌，加入PI熒光染液(50μg·ml-1PI，l0μg·ml-1RNA酶)4℃避光孵育30min，流式細(xì)胞儀分析DNA熒光強(qiáng)度，在流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，資料經(jīng)計(jì)算機(jī)多正態(tài)擬合分析，得出細(xì)胞群體在細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相的分布比例。

3 結(jié)果

3.1健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示，DDP組及健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清大劑量組A549/DDP G1期細(xì)胞比例明顯高于模型組(P<0.01)，而中、小劑量組無(wú)明顯變化(P>0.05)。DDP組及健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清各劑量組A549/DDP S期細(xì)胞比例均明顯低于模型組(P<0.01)；與DDP組相比，健脾益肺解毒方大劑量組G1期比例無(wú)明顯變化(P>0.05)，中、小劑量組G1期比例明顯低于DDP組(P<0.01)，而健脾益肺解毒方各劑量組S期比例均明顯高于DDP組(P<0.01)，且健脾益肺解毒方在S期細(xì)胞分布高于G0/G1。見(jiàn)表1。

表1 健脾益肺解毒方藥物血清對(duì)A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響

注：與模型組比較，1)P<0.01；與DDP組比較，2)P<0.01

3.2健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清與DDP合用時(shí)對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示，健脾益肺解毒方藥物血清各劑量組與DDP合用后，肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP G1期比例均明顯高于模型組和DDP組(P<0.01)，S期細(xì)胞比例均明顯低于模型組和DDP組(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 健脾益肺解毒方藥物血清與DDP合用時(shí)對(duì)A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響

注：與模型組比較，1)P<0.01；與DDP組比較，2)P<0.01

3.3健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清與VRP合用時(shí)對(duì)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響結(jié)果顯示，VRP及健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清合用VRP后，各組A549/DDP G0/G1期細(xì)胞比例均明顯高于DDP組(P<0.01)，S期細(xì)胞比例均明顯低于DDP組(P<0.01)；健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清大、中、小劑量組合用VRP后，大、中劑量組A549/DDP G1期細(xì)胞比例均高于VRP組(P<0.05)，健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清各劑量組S期細(xì)胞比例均明顯低于VRP組(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清與VRP合用時(shí)對(duì)A549/DDP耐藥細(xì)胞周期的影響

注：與DDP組比較，1)P<0.01；與VRP組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

4 討論

化療耐藥是肺癌治療不理想的原因之一。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，肺癌中晚期和化療后均有肺脾虛損的表現(xiàn)，尤其是肺癌化療后尤為突出。我們根據(jù)中醫(yī)五行相生理論，脾屬土，肺屬金，對(duì)肺癌化療和中晚期采用健脾益肺為主以達(dá)培土生金，化瘀解毒為輔以治肺之癌瘤，收到了較好的臨床效果。健脾益肺解毒方由黨參、黃芪、豬苓、半枝蓮、仙鶴草等藥組成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明黃芪多糖可預(yù)防及減輕化療后骨髓抑制，黨參多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用，黃芪可明顯抑制人肺癌細(xì)胞增殖，減少肺癌小鼠肺部轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存期，提高體內(nèi)免疫功能[2-4]。豬苓多糖主要通過(guò)抗氧化、清除自由基，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，影響腫瘤基因表達(dá)和增強(qiáng)免疫功能等方面發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。中藥半枝蓮有抗突變、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、免疫增強(qiáng)、抗氧化、抑制端粒酶活性、抑制腫瘤血管生成等作用[6]。仙鶴草不論是對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，還是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物移植性腫瘤均有抑制或殺傷作用，尤其是在抑制瘤體增殖，促進(jìn)癌癥患者康復(fù)，改善臨床癥狀，減輕放化療的毒副作用，提高生存質(zhì)量，阻止癌前病變，以及提高機(jī)體免疫功能等諸多方面，均有明顯的效果[7]。表明健脾益肺解毒方的藥物組成不但符合中醫(yī)的組方原則，而且具有現(xiàn)代藥理基礎(chǔ)。

以南京寧蕪鐵路部分節(jié)點(diǎn)為例，結(jié)合綠道系統(tǒng)的打造，將原有跨內(nèi)秦淮河的鐵路橋保留再利用，改造成為慢行專用橋，串聯(lián)起河道兩側(cè)的慢行空間，由此既落實(shí)了“面”與“線”層面城市綠道系統(tǒng)的構(gòu)建要求，同時(shí)也提升了跨河慢行聯(lián)系的連續(xù)性與安全性。

細(xì)胞周期反映了細(xì)胞的增殖過(guò)程，細(xì)胞周期長(zhǎng)短主要決定于G1期，G1期阻滯可使細(xì)胞周期延長(zhǎng)，增殖分裂減慢。惡性腫瘤的本質(zhì)在于細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)失控，出現(xiàn)無(wú)限制細(xì)胞增殖和分裂。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，細(xì)胞周期的調(diào)控異常導(dǎo)致細(xì)胞的失控性增殖，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要特征，幾乎所有的腫瘤都有細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的破壞導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控、分化受阻、凋亡異常的特征[8]。

本研究結(jié)果顯示，健脾益肺解毒方在S期細(xì)胞分布高于G0/G1，表明單用健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清不能阻滯A549/DDP細(xì)胞于G0/G1，從而使進(jìn)入S期的細(xì)胞增加，對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP增殖無(wú)抑制作用。但是健脾益肺解毒方藥物血清與DDP合用后，A549/DDP G1期比例均明顯高于DDP組，S期細(xì)胞比例均明顯低于DDP組，表明健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清與DDP合用后，具有協(xié)同DDP阻滯肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞于G0/G1期，減少增殖細(xì)胞在S期的分布，從而減少肺癌細(xì)胞在S期DNA的合成，抑制肺癌耐藥細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)肺癌A549/DDP耐藥細(xì)胞的耐藥性，增強(qiáng)化療敏感性。

維拉帕米(VRP)是一種鈣通道阻滯劑，能與P-糖蛋白(P-gp)結(jié)合，抑制細(xì)胞毒性藥物外排，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度升高，細(xì)胞毒效應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)多藥耐藥具有逆轉(zhuǎn)作用，極大地增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]。研究結(jié)果顯示，健脾益肺解毒方藥物血清與VRP合用后，A549/DDP G1期比例均明顯高于VRP組，S期細(xì)胞比例均明顯低于VRP組。說(shuō)明健脾益肺解毒方荷瘤動(dòng)物藥物血清與VRP合用后，能協(xié)同增強(qiáng)VRP阻滯肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP于G0/G1期，減少增殖細(xì)胞在S期的分布，從而抑制肺癌耐藥細(xì)胞周期的增殖。由此認(rèn)為健脾益肺解毒方藥物血清抑制肺癌耐藥細(xì)胞周期增殖的機(jī)理可能與增強(qiáng)細(xì)胞鈣通道阻滯作用密切相關(guān)。

[1]孟 華，曹 勇，夏清華.健脾益肺化瘀方對(duì)小鼠Lewis肺癌作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007(1)：11-12.

[2]鄭召鵬，楊衛(wèi)兵，李 寧，等.注射用黃芪多糖預(yù)防非小細(xì)胞肺癌化療后骨髓抑制的療效觀察[J].中草藥，2013，44(2)：208-209.

[3]楊 瑾，袁德培，陳龍全，等.黨參多糖類成分抗腫瘤活性的研究進(jìn)展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，28(3)：67-68.

[4]吳朝妍，張瑩雯，葉太生，等.NF-κB抑制介導(dǎo)的黃芪多糖抗人肺癌細(xì)胞效應(yīng)[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，34(2)：174-177.

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[7]巴曉雨，何永志，路 芳，等.仙鶴草研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(5)：258-261

[8]王 昕.細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生的研究[J].中國(guó)民康醫(yī)學(xué)，2010，22(16)：2135-2136.

[9]李小兵.靶動(dòng)脈灌注維拉帕米聯(lián)合化療藥物介入治療晚期肺癌的臨床療效分析[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2013，21(12)：130-131.

中醫(yī)故事

郎中對(duì)對(duì)子

民國(guó)時(shí)期，有個(gè)縣太爺自以為是天下奇才，喜歡與人比詠詩(shī)作對(duì)。有一天下雨，縣太爺硬要一個(gè)看病的郎中與他對(duì)對(duì)子。郎中無(wú)奈，也只好硬著頭皮，等著縣太爺出題。

縣太爺以郎中打著的雨傘為題，道出一聯(lián)：黑柄雙雨傘；

郎中不會(huì)對(duì)對(duì)子，只好順口打哇哇：銀翹八寶盤。

縣太爺說(shuō)：“我出的上聯(lián)是物件，你對(duì)的下聯(lián)是藥名，藥名對(duì)物件……，嗯，馬馬虎虎。好!我再出一聯(lián)你對(duì)對(duì)看。”說(shuō)完，眼一瞄，見(jiàn)前面裁縫鋪里師傅正拿著尺量布，就以其為題，道出一聯(lián)：三尺天青緞；

郎中三句不離本行，又隨口對(duì)出：六味地黃丸。

縣太爺說(shuō)：“你又是對(duì)的藥名吧？你光對(duì)藥名，我又不曉得到底有這些藥名沒(méi)有。這樣吧，我再出一聯(lián)，我以什么為題，你就以什么來(lái)對(duì)。”他說(shuō)罷，頭一偏，見(jiàn)路旁一戶人家有個(gè)丫頭正倚在門旁歪著腦袋朝外看人，就以這個(gè)丫頭為題，搖頭晃腦道出一題：小女子，紅光滿面，定知三從四德；

郎中心想：我對(duì)藥，你又說(shuō)不行；你看見(jiàn)人就出題，我又到哪里去找人來(lái)對(duì)呀？他愁眉苦臉地望著縣太爺，驀地心里一亮，有了，面前這位縣太爺不是人嗎？只見(jiàn)他盯著縣太爺，察言觀色，一字一句地說(shuō)：大老爺，面黃肌瘦，必有五癆七傷。

縣太爺正要發(fā)作，但轉(zhuǎn)念一想，是自己出題要他對(duì)的，而且對(duì)得又工穩(wěn)，真是啞巴吃黃連，有苦說(shuō)不出。可他還是忍不住罵了聲：小奴才!

郎中以為這又是縣太爺出的上聯(lián)，便脫口而出：大老爺!

縣太爺面紅耳赤，惱羞成怒，朝郎中大聲呵斥：該死!

郎中還是以為縣太爺在出對(duì)，又連忙對(duì)出下聯(lián)：無(wú)救!

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.73062)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2007Z3-E5091)。

曹勇，男，教授。研究方向：中醫(yī)腫瘤防治。E-mail:tcaoy@163.com。

1.廣東省深州市福田區(qū)中醫(yī)院(518034)；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系(510632)

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