聚乳酸手術保護膜在門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術中的應用

陳保星，許 冰，朱丙帥

（鄭州大學第一附屬醫院 肝膽胰外科 河南 鄭州 450052）

聚乳酸手術保護膜在門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術中的應用

陳保星，許 冰，朱丙帥

（鄭州大學第一附屬醫院 肝膽胰外科 河南 鄭州 450052）

目的：評價聚乳酸手術保護膜在門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術中防止粘連再生及減少新生血管的效果。方法：將40只SD大鼠隨機分為實驗組和對照組。兩組均以部分門靜脈結扎法建立肝前型門靜脈高壓癥大鼠模型，對照組僅行賁門周圍血管離斷術，實驗組行賁門周圍血管離斷術并用聚乳酸手術保護膜包繞賁門周圍創面。術后第4周處死大鼠，觀察賁門周圍組織粘連情況，進行宏觀分級，切取賁門及其周圍粘連組織，將標本蠟塊包埋后免疫組織化學染色觀察白細胞分化抗原34（cluster of differentiation 34，CD34）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況，觀察分析賁門周圍組織粘連程度及新生血管生成情況。結果：腹腔臟器粘連宏觀分級中，實驗組較對照組粘連臟器相對較少，粘連分級明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。免疫組織化學顯示，實驗組在粘連程度及新生血管生成情況上均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：聚乳酸手術保護膜在一定程度上可以預防、減少門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術后粘連形成以及新生血管生成。

聚乳酸手術保護膜；賁門周圍血管離斷術；血管內皮生長因子；白細胞分化抗原34

賁門周圍血管離斷術可用于門靜脈高壓癥的手術治療［1］，它是通過阻斷門靜脈系統與奇靜脈之間的側支循環，以達到控制門靜脈高壓癥引起的食管胃底靜脈曲張破裂出血的目的，但術后仍有一定的再出血率，楊鎮、陳立波等［2-3］報道單純斷流術組5年再出血率為3.3％～6.9％，10年再出血率為8.0％～13.3％。其中再出血原因可能包括：手術操作不規范、斷流不徹底；術后門靜脈高壓引起賁門周圍新生血管形成，致側支循環再建復發出血等。聚乳酸手術保護膜是一種特殊的可吸收材料，能夠有效的保護軟組織，防止術后軟組織粘連，減少術后創面粘連再生及新生血管形成。本實驗擬通過門靜脈主干部分結扎法復制大鼠肝前性門靜脈高壓癥模型［4］，然后對該模型大鼠行賁門周圍血管離斷術，其中實驗組行賁門周圍血管離斷術后應用聚乳酸手術保護膜包繞賁門創面，對照組單純行賁門周圍血管離斷術，觀察大鼠賁門周圍組織的粘連情況，評估聚乳酸手術保護膜阻止賁門周圍粘連形成及新生血管生成的效果，探討其對治療和再出血提供的線索。

1 材料和方法

1.1 材料 SD雄性大白鼠由河南省實驗動物中心提供；聚乳酸手術保護膜購自MAST Blosurgery Inc公司；VEGF（鼠抗人單克隆抗體）、CD34（鼠抗人單克隆抗體）購自Santa Cruz生物技術公司；SP試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉生物工程公司。

1.2 手術方法 將40只SD雄性大白鼠（180～200 g）隨機分為兩組，實驗組和對照組各20只。飼養條件：于有通氣裝置的飼養箱中，溫度20～25℃，濕度40％～60％，12 h光暗周期。手術前1周讓大鼠對實驗室環境進行適應。術前1 d晚上禁食12 h，手術當天禁食水。

以10％水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，無菌條件下作劍突下正中切口2.0～3.0 cm，進腹前生理鹽水沖洗無菌橡膠手套。游離門靜脈近肝端，在門靜脈外緣平行放置1個外徑為0.8 mm（21 G）的鈍性針頭，用3-0絲線結扎門靜脈主干及與之靠近的鈍性針頭（結扎點盡量靠近門靜脈左右分支處），拔出針頭后即可形成門靜脈部分結扎。實驗組以無損傷鉗徹底游離食管中下段及賁門后，剪取一1.5 cm×1.5 cm聚乳酸手術保護膜包繞賁門周圍（見圖1）。對照組僅游離食管中下段及賁門。術后4周處死大鼠，切取賁門及其周圍粘連組織，生理鹽水洗凈后固定于4％甲醛液中，石蠟包埋、切片，進行VEGF、CD34免疫組織化學檢驗［5-6］。

圖1 聚乳酸手術保護膜放置前后比較

1.3 評估標準

1.3.1 宏觀分級：參考The Diamond Classification［7］，對賁門周圍粘連范圍、粘連組織韌性分級。粘連范圍：0級賁門周圍無粘連，1級賁門周圍少許膜性粘連，2級肝左外葉、肝尾葉、賁門周圍粘連，3級與膈肌間粘連條帶形成，4級大網膜、小腸粘連。

1.3.2 免疫組化分析：①VEGF結果評定：VEGF蛋白陽性表達主要定位在胞漿或胞膜上，呈棕黃色或黃色的顆粒狀物質。陽性標準：以細胞漿被染為棕黃（褐）色為陽性，反之則為陰性。采用形態學圖像分析系統對各組免疫組化切片隨機采集、放大，輸入計算機，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），測定平均積分光密度值顯示相對含量。②微血管密度（MVD）的判定方法CD34陽性表達主要定位于血管內皮細胞的胞膜或胞漿中，呈現棕黃色的內皮細胞或內皮細胞簇團，其代表微血管密度（microvessel density，MVD）。按Weidner等［8］報道的計數方法，首先在低倍鏡（×100）下掃視整個切片，以染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為1個血管計數，尋找3個血管密度最高的區域（即所謂“熱點”），然后在200倍視野范圍分別計數每個區域的微血管數，取其平均值。

1.4 統計學方法 使用SPSS 17.0統計軟件，采用χ2檢驗、t檢驗、相關性分析，對實驗數據進行統計學分析。檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異統計學意義。

2 結果

2.1 腹腔臟器粘連宏觀表現 對照組粘連范圍所涉及臟器多為肝左外葉、肝尾葉、食管、胃底，少數存在大網膜、小腸粘連；實驗組所涉及的粘連臟器多為肝左外葉、胃底，無大網膜及小腸粘連（見圖2）。經統計學分析，兩組在粘連分級中差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖2 兩組大鼠腹腔臟器粘連情況比較

表1 大鼠腹腔臟器粘連范圍分級對比（n）

2.2 VEGF和CD34在各組標本中的表達 對照組大鼠賁門周圍組織VEGF主要表達在粘連組織成纖維細胞或內皮細胞的胞漿或胞膜上，數量較多，呈強陽性表達；而實驗組陽性細胞數較對照組明顯減少（見圖3），對照組大鼠賁門周圍組織 VEGF值高于實驗組，兩組差異具有統計學意義（P＜0.05）（見表2）。

圖3 VEGF在賁門周圍粘連組織中的表達（×400）

同時通過CD34血管標記物染色，對照組較多個體出現膠原纖維和彈性纖維增生均明顯，間質中大量新生血管形成，數量繁多，管徑大小不等。實驗組中個體纖維沉積較少，新生血管數量較對照組明顯減少，管徑相對較細（見圖4）。

圖4 CD34在賁門周圍粘連組織中的表達（×400）

根據CD34在血管內皮細胞表達情況判定MVD，對照組MVD值為（14.47±2.89），實驗組MVD值為（11.44±2.71），兩者差異具有統計學意義（P＜ 0.05）。對VEGF與MVD的直線相關性分析發現，兩者呈正相關（r=0.539，P＜0.05），即VEGF高表達的組織MVD呈現高趨勢（見表2）。

表2 VEGF及MVD在賁門周圍粘連組織中的表達及其相關性

3 討論

聚乳酸手術保護膜是一種特殊的可吸收材料，手術后在體內創面間使用該膜，可以減少創傷面之間的直接接觸，防止纖維組織細胞相互侵入，最大限度防止組織間不良粘連形成，預防術后創面粘連再生及新生血管形成。本研究在門靜脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術中應用聚乳酸手術保護膜包繞賁門周圍創面，觀察術后賁門周圍粘連及新生血管生成情況，發現實驗組大鼠賁門周圍組織粘連分級較對照組明顯降低，新生血管數量較對照組明顯減少，進而推斷在臨床門靜脈高壓患者賁門周圍血管離斷術中使用聚乳酸手術保護膜包繞食管中下段、胃底，預防門奇靜脈側支循環再建立，降低術后食管中下段、胃底靜脈曲張破裂再出血的發生率的可能性。

賁門周圍血管離斷術是通過阻斷門奇靜脈間反常血流，達到控制門靜脈高壓癥引起的食管胃底靜脈曲張破裂出血，被推薦為外科治療門靜脈高壓癥首選的急診手術方式。然而該術式對食管、胃底的廣泛剝離會造成局部組織的粘連、新生血管形成，導致側支循環再次開放，引起食管中下段、胃底靜脈曲張破裂再出血［9］。Makdissi等［10］進行臨床隨訪調查后發現，賁門周圍血管離斷術后，5 a內因食管中下段、胃底曲張靜脈破裂再出血的患者，在所有術后上消化道出血患者的比例達54.2％。因此賁門周圍血管離斷術后，減少賁門周圍組織粘連及新生血管形成，將對食管中下段、胃底靜脈曲張再形成甚至破裂再出血將會產生一定預防作用。本實驗中，實驗組腹腔粘連宏觀分級較對照組明顯降低（P＜0.05），具體表現為實驗組粘連范圍小，所涉及的粘連組織、器官相對較少，說明聚乳酸手術保護膜可有效降低賁門周圍血管離斷術后賁門周圍組織粘連形成。

大鼠賁門周圍血管離斷術后，在很多細胞、炎性因子、細胞因子、細胞外基質等相互作用后，最終形成賁門周圍粘連組織，并伴隨著組織新生血管形成。血管內皮生長因子（VEGF）是同源二聚體糖蛋白，有單一基因編碼表達的，能夠直接激發血管內皮細胞遷移、增殖及分裂、分化，并增加微小血管的通透性，是目前文獻上公認較強、研究較成熟的一種促血管生長因子［11］。Rout等［12］研究發現，粘連組織中VEGF mRNA與VEGF蛋白較正常組織高表達，提示VEGF參與了粘連形成，VEGF在粘連組織中的表達與粘連程度存在相關性，隨著粘連程度增加而表達增強。CD34在新生血管內皮細胞中的表達遠遠大于非新生血管內皮細胞，提示其作用可能與血管生成有關，是目前最敏感的新生血管內皮細胞標記物［13］。本實驗應用 VEGF與CD34從組織學角度評估賁門周圍粘連組織的粘連程度及新生血管情況。從免疫組織化學所呈現的結果看，兩組個體均存在不同程度粘連，對照組大鼠賁門周圍組織粘連較重，其VEGF表達明顯高于實驗組（P＜0.05），同時對照組新生血管數目較實驗組明顯增多（P＜0.05）。鑒于VEGF與血管生成的密切關系，我們同時研究了VEGF和MVD在粘連組織中的表達及相關性，VEGF高表達的對照組較低表達的實驗組的MVD值明顯增高，且差異具有統計學意義，兩者存在正相關，從而提示粘連形成與血管發生之間存在密切關系，其可能通過VEGF的高表達而促進新生血管生成。

綜上所述，根據本實驗結果及相關研究，聚乳酸手術保護膜在一定程度上可以預防、減少門脈高壓大鼠賁門周圍血管離斷術后粘連形成以及新生血管生成。由此推斷，對于臨床上門靜脈高壓患者，賁門周圍血管離斷術中應用聚乳酸手術保護膜包繞賁門周圍創面，對于減少術后新生血管形成，進而減少側支循環再開放，降低食管中下段及胃底靜脈曲張破裂再出血的發生率可能具有一定的治療效果。

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The application of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension rat model of pericardial devascularization

CHEN Baoxing，XU Bing，ZHU Bingshuai

（Department of Hepatopancreatobiliary，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

Objective：To assess the effects of polylactic acid operative protective film in the portal hypertension ratmodel of pericardial devascularization.M ethods：40 SD rats were random ly divided into two groups，including the experimental group and the control group.The experimental group and the control group were made prehepatic portal hypertension model by partial portal vein ligation.The rats of experimental group underwent pericardial devascularization with polylactic acid operative protective film surrounding the cardia wound and the rats of control group were only operated by pericardial devascularization.Ratswere sacrificed after four weeks and specimens collected were made paraffin immunohistochem ical staining to observe the expression of CD34 and VEGF.Observe and analyse the cardiac peripheral tissue adhesion degree and neovascularizationthe.Resu lts：The control group had a wide range of adhesion in the macroscopic classification，while experimental group involved fewer adhesion and organs.The experimental group classification adhesion decreased significantly comparing with the control group and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed that the experimental group were lower than the control group in the degree of adhesion and angiogenesis of cases，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Polylactic acid operative protective film can prevent and reduce adhesion formation and angiogenesis in portal hypertension ratsmodel of pericardial devascularization in a certain extent.Polylactic acid operative protective film may be helpful to reduce rebleeding incidence in patients with portal hypertension after pericardial devascularization.

polylactic acid operative protective film；pericardial devascularization；VEGF；CD34

R 332

10.3969/j.issn.1004-437X2014.11.004

2014-06-30）

·臨床研究·