不同發(fā)酵時期添加金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪，劉夢瀅，王立梅，齊斌，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇常熟 215500）

不同發(fā)酵時期添加金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪1，2，劉夢瀅1，王立梅1，2，齊斌1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，江蘇常熟 215500）

摘 要：通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，研究了Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+5種金屬離子在不同發(fā)酵時間添加對釀酒酵母CS10515-1 生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。實驗結(jié)果表明：在發(fā)酵初期（0 h），當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時，GSH的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。在15 h時，當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時，GSH產(chǎn)量為61.75 mg/L，比對照組提高82.01%。當(dāng)發(fā)酵至24 h時，金屬離子的添加對GSH的產(chǎn)量無明顯促進作用。

關(guān)鍵詞：谷胱甘肽；釀酒酵母；金屬離子

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，其分子中含有γ-谷氨酰基和活性巰基，是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1]，例如：它是許多酶反應(yīng)的輔基，可作為抗氧化劑[2]保護生物分子蛋白的巰基，清除體內(nèi)過多的自由基，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)以及糖代謝，具有預(yù)防糖尿病以及消除疲勞等作用[3-4]。

目前，利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH是最具潛力的方法[5]。GSH在生物體內(nèi)的合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成，這兩步反應(yīng)都需要ATP和金屬離子的參與[6]。另外金屬離子對于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP也有顯著影響[7]。因此，從金屬離子添加角度考察發(fā)酵過程谷胱甘肽產(chǎn)量有十分重要的意義。本文考察了在不同時間添加不同濃度的 Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+對釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響，旨在為以后的放大實驗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗室保存的經(jīng)化學(xué)誘變選育的釀酒酵母CS10515-1。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1240型紫外可見分光光度計：日本島津公司；Milli-QAdvantage超純水儀；美國Millipore公司；XSIO5DU型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機：日本日立公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基[12]；種子培養(yǎng)基：5°B′e 麥芽汁；發(fā)酵培養(yǎng)基：5°B′e麥芽汁。

1.4 麥芽汁的制備[8]

麥芽汁制備方法同文獻[8]。本實驗中，將制備好的 10°B′e 麥芽汁用波美計調(diào)配成 5°B′e。

1.5 培養(yǎng)方法

將活化好的一級種子以10%（體積分數(shù)）接種量接入二級種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，然后以10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30℃、180 r/min培養(yǎng)33 h。

1.6 金屬離子添加對GSH發(fā)酵的影響

分別考察0、15、24 h向發(fā)酵液中添加0.09 g/L的CuSO4、MgSO4、KCl、FeSO4、MnSO45 種 金 屬 鹽 對 GSH產(chǎn)量及生物量的影響。確定對谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量有促進作用的金屬離子，然后優(yōu)化金屬離子的最佳添加量。以不添加金屬離子作為空白對照，每個實驗做3個平行。

1.7 測定方法

生物量測定[8]；殘?zhí)橇繙y定[9]；GSH 產(chǎn)量測定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時間不同濃度金屬離子添加對谷胱甘肽發(fā)酵的影響

根據(jù)搖瓶發(fā)酵曲線，GSH的整個搖瓶發(fā)酵過程分為3個階段，分別是指數(shù)生長期（0～18h），平穩(wěn)期（18 h～26 h），細胞衰亡期（26 h～48 h）。由于谷胱甘肽為釀酒酵母的次級代謝產(chǎn)物，當(dāng)細胞生長至平穩(wěn)期時大量合成，因此分別考察了不同細胞生長時期添加不同濃度的金屬離子對于細胞合成谷胱甘肽的影響。

2.1.1 發(fā)酵初始添加金屬離子對GSH產(chǎn)量及生物量的影響

發(fā)酵初始添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對 GSH 產(chǎn)量的影響及生物量影響見圖1。

由圖1可知，發(fā)酵初期添加Mg2+、Fe2+、K+及Mn2+對GSH產(chǎn)量都有促進作用，此結(jié)論與Chi-Hsien Liu[10]、Tao Zhang[11]、Tan Zuo-Ping[12]、Jae-Young Cha[13]等在關(guān)于谷胱甘肽培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中的結(jié)論是一致的。可能由于在發(fā)酵初期細胞處于指數(shù)生長初期，細胞代謝較為迅速，酶系較為活躍，上述幾種金屬離子作為某些酶類的激活劑[14]，能夠在一定程度上提高酶的活力，從而促進GSH的合成。

圖1 不同金屬離子對GSH產(chǎn)量和細胞生物量的影響（0 h）Fig.1 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

在此基礎(chǔ)上，分別考察了對谷胱甘肽產(chǎn)量有顯著提高作用的3種金屬離子的最佳添加量，優(yōu)化后結(jié)果表明，當(dāng) K+，Mg2+，F(xiàn)e2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時，GSH 的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照組分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。

2.1.2 對數(shù)生長期后期（15 h）添加不同金屬離子對GSH產(chǎn)量及生物量的影響

對數(shù)生長期后期（15 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對GSH產(chǎn)量及生物量的影響見圖2。

圖2 不同金屬離子對GSH產(chǎn)量及細胞生物量的影響（15 h）Fig.2 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

由圖2可知，發(fā)酵至15 h時，發(fā)酵液中添加Mg2+對GSH產(chǎn)量及生物量都有明顯的促進作用，Mg2+的添加使GSH產(chǎn)量達到76.76 mg/L，相比對照組提高了39.70%。在釀酒酵母體內(nèi)，GSH作為次級代謝產(chǎn)物在細胞生長至穩(wěn)定期時大量合成，GSH生物合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成，而且在反應(yīng)時需要Mg2+的參與[6]，所以當(dāng)細胞生長至對數(shù)生長期后期時向發(fā)酵液中添加Mg2+比發(fā)酵初始添加效果更好。進一步優(yōu)化Mg2+添加量，最適添加量為0.09 g/L。

2.1.3 穩(wěn)定期（24 h）添加不同金屬離子對GSH產(chǎn)量及生物量的影響

穩(wěn)定期（24 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對 GSH產(chǎn)量及生物量的影響見圖3。

圖3 添加金屬離子對GSH產(chǎn)量和細胞生物量的影響（24 h）Fig.3 The influence of different metal ions on GSH production and biomass

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵至24 h時，細胞生長至穩(wěn)定期，此時向發(fā)酵液中添加金屬離子對谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量都起到了抑制作用，其中Cu2+對其影響最大。穩(wěn)定期時，發(fā)酵液中的碳源幾乎消耗殆盡，ATP合成量少，對細胞中GSH的合成不利因素增多，所以金屬離子的添加對于谷胱甘肽的合成不起作用，甚至對細胞還會起到毒害作用。如Cu2+可以誘導(dǎo)酵母細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，活性氧可以參與破壞細胞膜的流動性和滲透性，奪取質(zhì)膜和細胞器膜中不飽和脂肪酸的氫離子引起膜脂過氧化[15]。

3 結(jié)論

本文研究了當(dāng)細胞處于不同生長時期向發(fā)酵液添加金屬離子對GSH產(chǎn)量及生物量的影響。結(jié)果表明：

在發(fā)酵初始（0 h）添加 Mg2+、K+、Fe2+有利于促進GSH 的合成。當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L 時，GSH 的產(chǎn)量分別為 88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照分別提高了63.5%、36.58%和44.25%。

當(dāng)發(fā)酵至15 h，發(fā)酵液中添加Mg2+對GSH產(chǎn)量有促進作用，當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時，GSH產(chǎn)量達最大，為61.75 mg/L，比對照組提高82.01%。

當(dāng)發(fā)酵至24 h時，5種金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽及生物量均無促進作用。

金屬離子對于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP有顯著影響，進而對于生物體內(nèi)谷胱甘肽的合成影響很大，所以研究金屬離子的添加對谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量的影響為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。從上述結(jié)果看，不同階段銅離子的添加都對GSH產(chǎn)量及生物量起到了抑制作用，而杜君等的實驗結(jié)果表明，適宜濃度的銅離子可以氧化脅迫釀酒酵母細胞內(nèi)過量積累谷胱甘肽，所以，對于不同的菌種，起到正向脅迫作用的銅離子的濃度會相差很大，有待于我們進行進一步的研究，另外，在以后的實驗中可以考慮將起到脅迫和輔酶作用的金屬離子同時添加去提高谷胱甘肽產(chǎn)量，為后續(xù)的放大實驗及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Effects of Metal Ions on Glutathione Production by Saccharomyces Cerevisiae under Different Fermentation Times

ZHENG Li-xue1，2，LIU Meng-ying1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：The effect of Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+under different fermentation times on GSH fermentation by saccharomyces cerevisiae CS10515-1 were investigated in this paper.It was found that GSH production was 88.53 mg/L，52.73 mg/L，41.42 mg/L respectively，which increasing by 63.50%，36.58%and 44.25%than the controls under the conditions of adding amount was 0.15 g/L K+，0.12 g/L Mg2+and 0.09 g/L Fe2+at 0 hour.GSH production was 61.75 mg/L，which increasing 82.01%under the conditions of 0.09 g/L Mg2+at 15h.Metal ions's adding had no effect on GSH production at 24 h.

Key words：glutathione；Saccharomyces cerevisiae；metal ion

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.027

國家自然科學(xué)基金資助項目（31171758）；2011年度常熟理工學(xué)院“青藍工程”優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)對象

鄭麗雪（1982—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

齊斌（1965—），男（漢），研究員，博士，研究方向：糧食油脂與植物蛋白工程。

2013-01-05