不同發酵時期添加金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪，劉夢瀅，王立梅，齊斌，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟 215500）

不同發酵時期添加金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪1，2，劉夢瀅1，王立梅1，2，齊斌1，*

（1.常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇常熟 215500）

摘 要：通過搖瓶發酵培養，研究了Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+5種金屬離子在不同發酵時間添加對釀酒酵母CS10515-1 生產谷胱甘肽的影響。實驗結果表明：在發酵初期（0 h），當 K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時，GSH的產量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。在15 h時，當Mg2+添加量為0.09 g/L時，GSH產量為61.75 mg/L，比對照組提高82.01%。當發酵至24 h時，金屬離子的添加對GSH的產量無明顯促進作用。

關鍵詞：谷胱甘肽；釀酒酵母；金屬離子

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，其分子中含有γ-谷氨?；突钚詭€基，是GSH許多重要生理功能的結構基礎[1]，例如：它是許多酶反應的輔基，可作為抗氧化劑[2]保護生物分子蛋白的巰基，清除體內過多的自由基，參與體內三羧酸循環以及糖代謝，具有預防糖尿病以及消除疲勞等作用[3-4]。

目前，利用酵母發酵生產GSH是最具潛力的方法[5]。GSH在生物體內的合成由兩步依靠ATP的酶促反應構成，這兩步反應都需要ATP和金屬離子的參與[6]。另外金屬離子對于酵母體內高效大量的合成ATP也有顯著影響[7]。因此，從金屬離子添加角度考察發酵過程谷胱甘肽產量有十分重要的意義。本文考察了在不同時間添加不同濃度的 Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+對釀酒酵母生產谷胱甘肽的影響，旨在為以后的放大實驗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實驗室保存的經化學誘變選育的釀酒酵母CS10515-1。

1.2 儀器與設備

UV-1240型紫外可見分光光度計：日本島津公司；Milli-QAdvantage超純水儀；美國Millipore公司；XSIO5DU型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機：日本日立公司。

1.3 培養基

斜面培養基：PDA 培養基[12]；種子培養基：5°B′e 麥芽汁；發酵培養基：5°B′e麥芽汁。

1.4 麥芽汁的制備[8]

麥芽汁制備方法同文獻[8]。本實驗中，將制備好的 10°B′e 麥芽汁用波美計調配成 5°B′e。

1.5 培養方法

將活化好的一級種子以10%（體積分數）接種量接入二級種子培養基中，30℃、180 r/min培養18 h，然后以10%接種量轉接入發酵培養基中，溫度30℃、180 r/min培養33 h。

1.6 金屬離子添加對GSH發酵的影響

分別考察0、15、24 h向發酵液中添加0.09 g/L的CuSO4、MgSO4、KCl、FeSO4、MnSO45 種 金 屬 鹽 對 GSH產量及生物量的影響。確定對谷胱甘肽產量及生物量有促進作用的金屬離子，然后優化金屬離子的最佳添加量。以不添加金屬離子作為空白對照，每個實驗做3個平行。

1.7 測定方法

生物量測定[8]；殘糖量測定[9]；GSH 產量測定[8]。

2 結果與分析

2.1 不同時間不同濃度金屬離子添加對谷胱甘肽發酵的影響

根據搖瓶發酵曲線，GSH的整個搖瓶發酵過程分為3個階段，分別是指數生長期（0～18h），平穩期（18 h～26 h），細胞衰亡期（26 h～48 h）。由于谷胱甘肽為釀酒酵母的次級代謝產物，當細胞生長至平穩期時大量合成，因此分別考察了不同細胞生長時期添加不同濃度的金屬離子對于細胞合成谷胱甘肽的影響。

2.1.1 發酵初始添加金屬離子對GSH產量及生物量的影響

發酵初始添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對 GSH 產量的影響及生物量影響見圖1。

由圖1可知，發酵初期添加Mg2+、Fe2+、K+及Mn2+對GSH產量都有促進作用，此結論與Chi-Hsien Liu[10]、Tao Zhang[11]、Tan Zuo-Ping[12]、Jae-Young Cha[13]等在關于谷胱甘肽培養基優化的研究中的結論是一致的?？赡苡捎谠诎l酵初期細胞處于指數生長初期，細胞代謝較為迅速，酶系較為活躍，上述幾種金屬離子作為某些酶類的激活劑[14]，能夠在一定程度上提高酶的活力，從而促進GSH的合成。

圖1 不同金屬離子對GSH產量和細胞生物量的影響（0 h）Fig.1 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

在此基礎上，分別考察了對谷胱甘肽產量有顯著提高作用的3種金屬離子的最佳添加量，優化后結果表明，當 K+，Mg2+，Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時，GSH 的產量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照組分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。

2.1.2 對數生長期后期（15 h）添加不同金屬離子對GSH產量及生物量的影響

對數生長期后期（15 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對GSH產量及生物量的影響見圖2。

圖2 不同金屬離子對GSH產量及細胞生物量的影響（15 h）Fig.2 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

由圖2可知，發酵至15 h時，發酵液中添加Mg2+對GSH產量及生物量都有明顯的促進作用，Mg2+的添加使GSH產量達到76.76 mg/L，相比對照組提高了39.70%。在釀酒酵母體內，GSH作為次級代謝產物在細胞生長至穩定期時大量合成，GSH生物合成由兩步依靠ATP的酶促反應構成，而且在反應時需要Mg2+的參與[6]，所以當細胞生長至對數生長期后期時向發酵液中添加Mg2+比發酵初始添加效果更好。進一步優化Mg2+添加量，最適添加量為0.09 g/L。

2.1.3 穩定期（24 h）添加不同金屬離子對GSH產量及生物量的影響

穩定期（24 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對 GSH產量及生物量的影響見圖3。

圖3 添加金屬離子對GSH產量和細胞生物量的影響（24 h）Fig.3 The influence of different metal ions on GSH production and biomass

由圖3可知，當發酵至24 h時，細胞生長至穩定期，此時向發酵液中添加金屬離子對谷胱甘肽產量及生物量都起到了抑制作用，其中Cu2+對其影響最大。穩定期時，發酵液中的碳源幾乎消耗殆盡，ATP合成量少，對細胞中GSH的合成不利因素增多，所以金屬離子的添加對于谷胱甘肽的合成不起作用，甚至對細胞還會起到毒害作用。如Cu2+可以誘導酵母細胞內活性氧的產生，活性氧可以參與破壞細胞膜的流動性和滲透性，奪取質膜和細胞器膜中不飽和脂肪酸的氫離子引起膜脂過氧化[15]。

3 結論

本文研究了當細胞處于不同生長時期向發酵液添加金屬離子對GSH產量及生物量的影響。結果表明：

在發酵初始（0 h）添加 Mg2+、K+、Fe2+有利于促進GSH 的合成。當 K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L 時，GSH 的產量分別為 88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對照分別提高了63.5%、36.58%和44.25%。

當發酵至15 h，發酵液中添加Mg2+對GSH產量有促進作用，當Mg2+添加量為0.09 g/L時，GSH產量達最大，為61.75 mg/L，比對照組提高82.01%。

當發酵至24 h時，5種金屬離子對釀酒酵母合成谷胱甘肽及生物量均無促進作用。

金屬離子對于酵母體內高效大量的合成ATP有顯著影響，進而對于生物體內谷胱甘肽的合成影響很大，所以研究金屬離子的添加對谷胱甘肽產量及生物量的影響為后續實驗奠定了基礎。從上述結果看，不同階段銅離子的添加都對GSH產量及生物量起到了抑制作用，而杜君等的實驗結果表明，適宜濃度的銅離子可以氧化脅迫釀酒酵母細胞內過量積累谷胱甘肽，所以，對于不同的菌種，起到正向脅迫作用的銅離子的濃度會相差很大，有待于我們進行進一步的研究，另外，在以后的實驗中可以考慮將起到脅迫和輔酶作用的金屬離子同時添加去提高谷胱甘肽產量，為后續的放大實驗及工業化生產提供理論依據。

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[1]Tamas E,Istvan P,Attila S.Glutathione metabolism and protection against oxidative stress caused by peroxides in Penicillium Chrysogenum[J].Free Radic Biol Med,1997,23(5):809-814

[2]Bray T M,Taylor C G.Enhancement of tissue glutathione for antioxidant and immune functions in malnutrition[J].Biochem Pharma,1994,47(12):2113-2123

[3]Schoenberg M H,Brik D,Beger H G.Oxidative stress in acute and chronic pancreatitis[J].Am J Clin Nutr,1995,62:1306-1314

[4]Lang C A,Naryshkin S,Schneider D L.Low blood glutathione in healthy aging adults[J].J Lab Clin Med,1992,120:720-725

[5]LIANG Guobin,LIAO Xianyan,DU Guocheng,et al.Optimization of amino acids addition for efficient production of glutathione inCandida utilis[J].Biochemical Engineering Journal,2008,41(3):234-240

[6]熊智強.還原型谷胱甘肽高產菌的脅迫生理特性與高密度發酵過程優化技術[D].上海:華東理工大學,2010

[7]廖鮮艷,王蓓,堵國成,等.金屬離子對面包酵母合成ATP的影響機制初探[J].過程工程學報,2005,5(4):420-424

[8]鄭麗雪,胡耀輝,齊斌.釀酒酵母生產谷胱甘肽的培養條件的研究[J].食品科學,2007,28(10):391-395

[9]張惟杰.糖復合物生化研究技術[M].杭州:浙江大學出版社,1994:10

[10]Chi-Hsien Liu,Chin-Fa Hwang,Chii-Cherng Liao.Medium optimization for glutathione production bySaccharomyces cerevisiae[J].Process Biochemistry,1998,34(1999):17-23

[11]Tao Zhang,Shaohong Wen,Tianwei Tan.Optimization of the medium for glutathione production inSaccharomyces cerevisiae[J].Process Biochemistry,2006,42(2007):454-458

[12]Tan Zuo-Ping,Wang Shi-Tong,Du Guo-Cheng.Glutathione Fermentation Process Modeling Based on CCTSK Fuzzy Neural Network[J].Biotechnology,2008,7(1):73-79

[13]Jae-Young Cha,Jin-Chul Park,Young-Su Cho.Optimal Fermentation Conditions for Enhanced Glutathione Production bySaccharomyces cerevisiaeFF-8[J].The Journal of Microbiology,2004,42(1):51-55

[14]曾紹漢,阮湘元,蔡明招.谷胱甘肽與金屬離子相互作用研究進展[J].中國公共衛生,2009,25(7):882-884

[15]杜君,李海蘭,李慧,等.銅對葡萄酒釀酒酵母的氧化脅迫機制[J].中國農業科學,2011,44(2):369-378

Effects of Metal Ions on Glutathione Production by Saccharomyces Cerevisiae under Different Fermentation Times

ZHENG Li-xue1，2，LIU Meng-ying1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：The effect of Cu2+，Mg2+，K+，Fe2+，Mn2+under different fermentation times on GSH fermentation by saccharomyces cerevisiae CS10515-1 were investigated in this paper.It was found that GSH production was 88.53 mg/L，52.73 mg/L，41.42 mg/L respectively，which increasing by 63.50%，36.58%and 44.25%than the controls under the conditions of adding amount was 0.15 g/L K+，0.12 g/L Mg2+and 0.09 g/L Fe2+at 0 hour.GSH production was 61.75 mg/L，which increasing 82.01%under the conditions of 0.09 g/L Mg2+at 15h.Metal ions's adding had no effect on GSH production at 24 h.

Key words：glutathione；Saccharomyces cerevisiae；metal ion

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.027

國家自然科學基金資助項目（31171758）；2011年度常熟理工學院“青藍工程”優秀青年骨干教師培養對象

鄭麗雪（1982—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品生物技術。

齊斌（1965—），男（漢），研究員，博士，研究方向：糧食油脂與植物蛋白工程。

2013-01-05