不同發(fā)酵時(shí)期添加金屬離子對(duì)釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪，劉夢(mèng)瀅，王立梅，齊斌，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟 215500）

不同發(fā)酵時(shí)期添加金屬離子對(duì)釀酒酵母合成谷胱甘肽的影響

鄭麗雪1，2，劉夢(mèng)瀅1，王立梅1，2，齊斌1，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟 215500）

摘 要：通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，研究了Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+5種金屬離子在不同發(fā)酵時(shí)間添加對(duì)釀酒酵母CS10515-1 生產(chǎn)谷胱甘肽的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在發(fā)酵初期（0 h），當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時(shí)，GSH的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對(duì)照分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。在15 h時(shí)，當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時(shí)，GSH產(chǎn)量為61.75 mg/L，比對(duì)照組提高82.01%。當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí)，金屬離子的添加對(duì)GSH的產(chǎn)量無明顯促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：谷胱甘肽；釀酒酵母；金屬離子

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成的三肽化合物，其分子中含有γ-谷氨酰基和活性巰基，是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[1]，例如：它是許多酶反應(yīng)的輔基，可作為抗氧化劑[2]保護(hù)生物分子蛋白的巰基，清除體內(nèi)過多的自由基，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)以及糖代謝，具有預(yù)防糖尿病以及消除疲勞等作用[3-4]。

目前，利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)GSH是最具潛力的方法[5]。GSH在生物體內(nèi)的合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成，這兩步反應(yīng)都需要ATP和金屬離子的參與[6]。另外金屬離子對(duì)于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP也有顯著影響[7]。因此，從金屬離子添加角度考察發(fā)酵過程谷胱甘肽產(chǎn)量有十分重要的意義。本文考察了在不同時(shí)間添加不同濃度的 Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+對(duì)釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的影響，旨在為以后的放大實(shí)驗(yàn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)化學(xué)誘變選育的釀酒酵母CS10515-1。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1240型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Milli-QAdvantage超純水儀；美國Millipore公司；XSIO5DU型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基[12]；種子培養(yǎng)基：5°B′e 麥芽汁；發(fā)酵培養(yǎng)基：5°B′e麥芽汁。

1.4 麥芽汁的制備[8]

麥芽汁制備方法同文獻(xiàn)[8]。本實(shí)驗(yàn)中，將制備好的 10°B′e 麥芽汁用波美計(jì)調(diào)配成 5°B′e。

1.5 培養(yǎng)方法

將活化好的一級(jí)種子以10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，然后以10%接種量轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30℃、180 r/min培養(yǎng)33 h。

1.6 金屬離子添加對(duì)GSH發(fā)酵的影響

分別考察0、15、24 h向發(fā)酵液中添加0.09 g/L的CuSO4、MgSO4、KCl、FeSO4、MnSO45 種 金 屬 鹽 對(duì) GSH產(chǎn)量及生物量的影響。確定對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量有促進(jìn)作用的金屬離子，然后優(yōu)化金屬離子的最佳添加量。以不添加金屬離子作為空白對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.7 測(cè)定方法

生物量測(cè)定[8]；殘?zhí)橇繙y(cè)定[9]；GSH 產(chǎn)量測(cè)定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間不同濃度金屬離子添加對(duì)谷胱甘肽發(fā)酵的影響

根據(jù)搖瓶發(fā)酵曲線，GSH的整個(gè)搖瓶發(fā)酵過程分為3個(gè)階段，分別是指數(shù)生長期（0～18h），平穩(wěn)期（18 h～26 h），細(xì)胞衰亡期（26 h～48 h）。由于谷胱甘肽為釀酒酵母的次級(jí)代謝產(chǎn)物，當(dāng)細(xì)胞生長至平穩(wěn)期時(shí)大量合成，因此分別考察了不同細(xì)胞生長時(shí)期添加不同濃度的金屬離子對(duì)于細(xì)胞合成谷胱甘肽的影響。

2.1.1 發(fā)酵初始添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響

發(fā)酵初始添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì) GSH 產(chǎn)量的影響及生物量影響見圖1。

由圖1可知，發(fā)酵初期添加Mg2+、Fe2+、K+及Mn2+對(duì)GSH產(chǎn)量都有促進(jìn)作用，此結(jié)論與Chi-Hsien Liu[10]、Tao Zhang[11]、Tan Zuo-Ping[12]、Jae-Young Cha[13]等在關(guān)于谷胱甘肽培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中的結(jié)論是一致的。可能由于在發(fā)酵初期細(xì)胞處于指數(shù)生長初期，細(xì)胞代謝較為迅速，酶系較為活躍，上述幾種金屬離子作為某些酶類的激活劑[14]，能夠在一定程度上提高酶的活力，從而促進(jìn)GSH的合成。

圖1 不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量和細(xì)胞生物量的影響（0 h）Fig.1 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

在此基礎(chǔ)上，分別考察了對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量有顯著提高作用的3種金屬離子的最佳添加量，優(yōu)化后結(jié)果表明，當(dāng) K+，Mg2+，F(xiàn)e2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L時(shí)，GSH 的產(chǎn)量分別為88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對(duì)照組分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。

2.1.2 對(duì)數(shù)生長期后期（15 h）添加不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響

對(duì)數(shù)生長期后期（15 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響見圖2。

圖2 不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及細(xì)胞生物量的影響（15 h）Fig.2 Effects of different metal ions on glutathione production and biomass

由圖2可知，發(fā)酵至15 h時(shí)，發(fā)酵液中添加Mg2+對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量都有明顯的促進(jìn)作用，Mg2+的添加使GSH產(chǎn)量達(dá)到76.76 mg/L，相比對(duì)照組提高了39.70%。在釀酒酵母體內(nèi)，GSH作為次級(jí)代謝產(chǎn)物在細(xì)胞生長至穩(wěn)定期時(shí)大量合成，GSH生物合成由兩步依靠ATP的酶促反應(yīng)構(gòu)成，而且在反應(yīng)時(shí)需要Mg2+的參與[6]，所以當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期后期時(shí)向發(fā)酵液中添加Mg2+比發(fā)酵初始添加效果更好。進(jìn)一步優(yōu)化Mg2+添加量，最適添加量為0.09 g/L。

2.1.3 穩(wěn)定期（24 h）添加不同金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響

穩(wěn)定期（24 h）添加 Cu2+、Mg2+、K+、Fe2+、Mn2+對(duì) GSH產(chǎn)量及生物量的影響見圖3。

圖3 添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量和細(xì)胞生物量的影響（24 h）Fig.3 The influence of different metal ions on GSH production and biomass

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí)，細(xì)胞生長至穩(wěn)定期，此時(shí)向發(fā)酵液中添加金屬離子對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量都起到了抑制作用，其中Cu2+對(duì)其影響最大。穩(wěn)定期時(shí)，發(fā)酵液中的碳源幾乎消耗殆盡，ATP合成量少，對(duì)細(xì)胞中GSH的合成不利因素增多，所以金屬離子的添加對(duì)于谷胱甘肽的合成不起作用，甚至對(duì)細(xì)胞還會(huì)起到毒害作用。如Cu2+可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，活性氧可以參與破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性和滲透性，奪取質(zhì)膜和細(xì)胞器膜中不飽和脂肪酸的氫離子引起膜脂過氧化[15]。

3 結(jié)論

本文研究了當(dāng)細(xì)胞處于不同生長時(shí)期向發(fā)酵液添加金屬離子對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量的影響。結(jié)果表明：

在發(fā)酵初始（0 h）添加 Mg2+、K+、Fe2+有利于促進(jìn)GSH 的合成。當(dāng) K+、Mg2+、Fe2+添加量分別為 0.15、0.12、0.09 g/L 時(shí)，GSH 的產(chǎn)量分別為 88.53、52.73、41.42 mg/L，相比空白對(duì)照分別提高了63.5%、36.58%和44.25%。

當(dāng)發(fā)酵至15 h，發(fā)酵液中添加Mg2+對(duì)GSH產(chǎn)量有促進(jìn)作用，當(dāng)Mg2+添加量為0.09 g/L時(shí)，GSH產(chǎn)量達(dá)最大，為61.75 mg/L，比對(duì)照組提高82.01%。

當(dāng)發(fā)酵至24 h時(shí)，5種金屬離子對(duì)釀酒酵母合成谷胱甘肽及生物量均無促進(jìn)作用。

金屬離子對(duì)于酵母體內(nèi)高效大量的合成ATP有顯著影響，進(jìn)而對(duì)于生物體內(nèi)谷胱甘肽的合成影響很大，所以研究金屬離子的添加對(duì)谷胱甘肽產(chǎn)量及生物量的影響為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。從上述結(jié)果看，不同階段銅離子的添加都對(duì)GSH產(chǎn)量及生物量起到了抑制作用，而杜君等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，適宜濃度的銅離子可以氧化脅迫釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)過量積累谷胱甘肽，所以，對(duì)于不同的菌種，起到正向脅迫作用的銅離子的濃度會(huì)相差很大，有待于我們進(jìn)行進(jìn)一步的研究，另外，在以后的實(shí)驗(yàn)中可以考慮將起到脅迫和輔酶作用的金屬離子同時(shí)添加去提高谷胱甘肽產(chǎn)量，為后續(xù)的放大實(shí)驗(yàn)及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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Effects of Metal Ions on Glutathione Production by Saccharomyces Cerevisiae under Different Fermentation Times

ZHENG Li-xue1，2，LIU Meng-ying1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：The effect of Cu2+，Mg2+，K+，F(xiàn)e2+，Mn2+under different fermentation times on GSH fermentation by saccharomyces cerevisiae CS10515-1 were investigated in this paper.It was found that GSH production was 88.53 mg/L，52.73 mg/L，41.42 mg/L respectively，which increasing by 63.50%，36.58%and 44.25%than the controls under the conditions of adding amount was 0.15 g/L K+，0.12 g/L Mg2+and 0.09 g/L Fe2+at 0 hour.GSH production was 61.75 mg/L，which increasing 82.01%under the conditions of 0.09 g/L Mg2+at 15h.Metal ions's adding had no effect on GSH production at 24 h.

Key words：glutathione；Saccharomyces cerevisiae；metal ion

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2014.06.027

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31171758）；2011年度常熟理工學(xué)院“青藍(lán)工程”優(yōu)秀青年骨干教師培養(yǎng)對(duì)象

鄭麗雪（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。

齊斌（1965—），男（漢），研究員，博士，研究方向：糧食油脂與植物蛋白工程。

2013-01-05