秋水仙素注射大蒜花苞誘導四倍體的研究

薛小艷 劉世琦 郭會平 孫亞麗 于新會 連海峰

（山東農業大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，農業部黃淮地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，山東泰安 271018）

秋水仙素注射大蒜花苞誘導四倍體的研究

薛小艷 劉世琦*郭會平 孫亞麗 于新會 連海峰

（山東農業大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，農業部黃淮地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，山東泰安 271018）

為獲得染色體加倍的大蒜植株，用0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的秋水仙素注射蒼山糙蒜和金蒜3號的花苞，并在不同生長調節劑組合的MS培養基上培養花苞內形成的氣生鱗莖，當再生體系建立后，對根尖進行倍性鑒定。結果表明，MS基本培養基添加0.05 mg·L-1NAA和2.0 mg·L-1KT能誘導較多的氣生鱗莖萌發，直徑4～5 mm的氣生鱗莖萌發率最高，且蒼山糙蒜氣生鱗莖的萌發率整體比金蒜3號高。秋水仙素注射花苞后，金蒜3號的花苞死亡率遠遠高于蒼山糙蒜。隨著秋水仙素濃度增大，花苞內形成氣生鱗莖數不斷降低，染色體加倍率升高。蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度處理下四倍體誘導率最高，為7.69%；金蒜3號以0.15%秋水仙素濃度處理下四倍體誘導率最高，為11.76%。

大蒜花苞；氣生鱗莖；組織培養；四倍體；秋水仙素

大蒜（Allium sativumL.）有性雜交困難，自然變異有限，多倍體育種成為無性繁殖大蒜作物改良品種的有效途徑之一（郭瑞峰和咸豐，2011）。秋水仙素（colchicine）可通過抑制或破壞紡錘體的形成，使細胞不能分裂，但姐妹染色單體仍能最終分開，并進一步重組成一個染色體數目加倍的細胞核的途徑誘導染色體加倍（周明龍，2012），因而作為較為理想的多倍體誘變劑廣泛使用（Sun et al.，2009；Kulkarni & Borse，2010）。秋水仙素通常采用浸種、滴涂和注射生長點等方法誘導植物無性階段產生多倍體（Takamura & Miyajima，1996；郭啟高 等，2000）。

大蒜氣生鱗莖是由蒜薹上花托的小鱗芽發育而成，通常每個花苞原基可形成10～40個氣生鱗莖（張素芝和李紀蓉，2006；馬雯 等，2011）。氣生鱗莖體積小，數量多，帶病毒程度低，易發育成獨立的試管苗（張素芝和李紀蓉，2006）。相關研究表明，以氣生鱗莖為外植體的大蒜愈傷組織途徑或不定芽途徑的組織培養再生體系均可獲得染色體加倍效果，但不定芽途徑的植株再生報道相對較少且存在技術障礙（馬雯 等，2011；袁學軍和李艷麗，2011）。

本試驗以大蒜花苞為試驗材料，通過秋水仙素注射花苞腔的方法，研究了秋水仙素對花苞及形成氣生鱗莖數的影響，并采用不定芽途徑離體組織培養法將花苞內形成的氣生鱗莖培養成試管苗，以期獲得四倍體大蒜植株，為大蒜多倍體誘導育種和新種質的創新提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大蒜品種蒼山糙蒜和金蒜3號。

1.2 試驗方法

1.2.1 秋水仙素對田間大蒜花苞的注射處理 大蒜于2012年10月5日種植于山東農業大學園藝實驗站，采用常規水肥管理。于2013年5月6日大蒜抽薹花苞初期，用秋水仙素對花苞腔進行注射處理：每個品種共處理80株花苞，分7：00、16：00兩批，采用濃度為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的秋水仙素注射花苞腔內原基生長點，每次注射0.1 mL，每天1次，連續注射3次，對照用清水處理，3次重復。于2013年5月27日采收花苞內形成的氣生鱗莖，于4℃貯藏15 d后進行大蒜氣生鱗莖萌發的組織培養及再生植株的倍性鑒定。

1.2.2 氣生鱗莖室內組織培養的植株再生 將用清水處理、4℃貯藏15 d的氣生鱗莖剝皮，用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，4%次氯酸鈉消毒35 min，無菌水沖洗3次，將其接種于不同誘芽培養基中誘導芽萌發，計算氣生鱗莖萌發率。

設置3種培養基進行誘芽培養基配方的篩選。1 號培養基：MS+NAA 0.05 mg·L-1+BA 0.1 mg·L-1（馬雯 等，2011）；2 號培養基：MS+NAA 2.0 mg·L-1+ BA 6.0 mg·L-1（張素芝和李紀蓉，2006）；3號培養基：MS+NAA 0.05 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1。培養基添加30 g·L-1蔗糖和 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

將用秋水仙素處理、4℃貯藏15 d的氣生鱗莖剝皮，將其接種于3號培養基中，研究氣生鱗莖粒子大小對萌發率的影響。之后繼續在3號培養基上培養形成再生植株。組培室培養條件為：（25±1）℃，光照強度 60 μmol·m-2·s-1，光照時間 16 h·d-1。

1.2.3 根尖染色體數目的鑒定 將組培苗培養60 d后，視組培苗的生根情況，取1～2 cm的根，參照文獻（朱徽，1982；饒小珍 等，2003；孫奇 等，2011）進行預處理、固定、解離、染色。以及鏡檢的方法，經多次試驗篩選出了適宜大蒜根尖染色體計數的直接壓片鑒定法。

取氣生鱗莖培養所得小苗的粗壯根系，每株取1～2個生長旺盛的根尖，在25℃飽和對二氯苯水溶液中預處理3 h，然后用現配制的卡諾固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）在4℃下固定30 min，在95%酒精、85%酒精和70%的酒精中依次洗滌20 min后，放入70%的酒精中保存于4 ℃冰箱中待用；制片時，水洗凈根尖后，用1 mol·L-1的鹽酸在60℃條件下解離8 min，倒出鹽酸，再加清水浸洗3次，最后放于清水中30 min后染色；染色時，切取根尖2～3 mm置于載玻片中，加1滴卡寶品紅染液，染色5 min后，蓋上蓋玻片，壓片，在熒光顯微鏡下觀察染色體數目。

所有試驗數據采用 DPS 6.55 和 Excel 2003 進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同誘導培養基對氣生鱗莖萌發率的影響

由表1可知，不同培養條件下氣生鱗莖萌發率差異極顯著。氣生鱗莖在3號培養基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1）萌發率最高，蒼山糙蒜萌發率高達75.91%，金蒜3號萌發率高達63.59%。

表1 不同誘導培養基對氣生鱗莖萌發率的影響

圖1 大蒜氣生鱗莖在不同培養基上的發育狀況

氣生鱗莖在1號培養基上發育異常，從根部產生芽，不適宜氣生鱗莖的正常萌發（圖1-a、A）；氣生鱗莖在2號培養基上發育正常，部分根部產生芽，部分莖尖發芽，有部分氣生鱗莖正常萌發（圖1-b、B）；氣生鱗莖在3號培養基上發育正常，莖尖發芽，適于氣生鱗莖的正常萌發（圖1-c、C）。

2.2 粒子大小對氣生鱗莖萌發率的影響

無菌條件下，將氣生鱗莖培養于3號培養基上，結果發現，氣生鱗莖萌發不僅受培養環境的影響，還受氣生鱗莖粒子大小的影響。粒子較小和較大都不利于氣生鱗莖的萌發，粒子直徑4～5 mm時，氣生鱗莖萌發率最高，且蒼山糙蒜的氣生鱗莖萌發率整體比金蒜3號高（圖2）。

2.3 大蒜氣生鱗莖組織培養條件下的發育變化

無菌條件下，將氣生鱗莖接種于3號培養基（圖3-a、A）上；培養 7～10 d 后莖尖轉綠（圖 3-b、B）；約經過 20 d，莖尖發芽（圖 3-c、C）；60 d后生根成苗（圖3-d、D）。

圖2 粒子大小對氣生鱗莖萌發率的影響

圖3 大蒜氣生鱗莖的植株再生

2.4 秋水仙素對花苞及形成氣生鱗莖數的影響

由表2可知，秋水仙素注射花苞后，金蒜3號的花苞死亡率遠遠高于蒼山糙蒜，且隨著秋水仙素濃度的增大，花苞內形成的氣生鱗莖數隨之減少，直徑4～5 mm蒼山糙蒜氣生鱗莖粒子率隨之有所降低，直徑4～5 mm金蒜3號氣生鱗莖粒子率先升高后降低。可見秋水仙素通過影響粒子直徑大小間接影響了氣生鱗莖的萌發率。

2.5 秋水仙素對蒼山糙蒜和金蒜3號的倍性誘導效應

由表3可以看出，0.15%秋水仙素注射蒼山糙蒜花苞對染色體加倍的誘導率低于金蒜3號，不同濃度秋水仙素處理的氣生鱗莖的倍性變化規律基本一致，即隨著秋水仙素濃度增大，二倍體率降低，嵌合體率升高，四倍體率也升高（0.20%秋水仙素處理金蒜3號除外）。蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度下四倍體誘導率最高，為7.69%；金蒜3號以0.15%秋水仙素濃度下四倍體誘導率最高，為11.76%。

表2 秋水仙素對花苞及形成氣生鱗莖的影響

表3 秋水仙素對花苞內氣生鱗莖的誘導變異

由圖4可以看出用根尖壓片法鏡檢觀察染色體條數，氣生鱗莖得到的小苗，不僅有16條染色體的二倍體植株（圖4-a）和32條染色體的四倍體植株（圖4-c），還有一些嵌合體（圖4-b）。

圖4 二倍體、嵌合體和四倍體植株的染色體

3 結論與討論

本試驗通過不同培養基配方篩選發現，不同生長調節劑組合的MS培養基對氣生鱗莖的萌發影響較大。氣生鱗莖在1號培養基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+BA 0.1 mg·L-1） 上 發 育 異 常， 從根部產生芽，不適宜氣生鱗莖的正常萌發；氣生鱗莖在 2 號培養基（MS+NAA 2.0 mg·L-1+BA 6.0 mg·L-1）上部分發育正常，莖尖發芽，但正常萌發率較低。這與張素芝和李紀蓉（2006）、馬雯等（2011）的研究結果有所不同，可能是因為大蒜品種間有差異，對氣生鱗莖的萌發造成不同的影響。氣生鱗莖在 3號培養基（MS+NAA 0.05 mg·L-1+ KT 2.0 mg·L-1）培養條件上發育正常，莖尖發芽，正常萌發率最高，蒼山糙蒜萌發率達75.91%，金蒜3號萌發率達63.5%。2個品種間萌發率的差異可能是由于品種間差異造成的，比如生理休眠期因素（陳沁濱 等，2007）。

大蒜氣生鱗莖萌發不僅受培養環境的影響，還受粒子大小的影響。粒子較小和較大都不利于氣生鱗莖的萌發，粒子直徑為4～5 mm時，萌發率最高。不同大小的氣生鱗莖萌發率差異很大，這與氣生鱗莖的休眠情況不同有關。較小的氣生鱗莖由于種皮障礙，成熟度差，休眠程度高，不易打破（楊期和 等，2003）。較大的氣生鱗莖發育較早，進入了生理休眠期，需滿足冷溫需求量才能解除休眠（徐紅艷 等，2013）。直徑4～5 mm的氣生鱗莖，未受到種皮障礙，也未進入生理休眠期，尚處于養分積累和鱗莖形成期，其體內物質代謝旺盛，極易萌發。

采用秋水仙素注射蒼山糙蒜和金蒜3號花苞，二者均獲得了一定頻率的四倍體試管苗。經過比較發現，秋水仙素注射金蒜3號的花苞死亡率遠遠高于蒼山糙蒜，這可能是因為金蒜3號花苞和蒼山糙蒜花苞對秋水仙素的敏感程度不同所致。秋水仙素的毒害性較大，如果處理不當，不僅無法使植物細胞染色體加倍，還會對處理材料造成嚴重的毒害作用，甚至使處理材料死亡，對誘變效率有較大的影響（鄭永強和徐坤，2003）。因此需要針對不同材料篩選合適的處理濃度。

蒼山糙蒜以0.20%秋水仙素濃度下四倍體誘導率最高，為7.69%；金蒜3號以0.15%秋水仙素濃度下四倍體誘導率最高，為11.76%。此次試驗獲得了四倍體大蒜植株，為大蒜多倍體誘導育種和新種質創新提供了新的途徑。

秋水仙素注射花苞，形成的氣生鱗莖經組織培養獲得試管苗，用根尖壓片法鏡檢觀察染色體條數，發現不僅有16條染色體的二倍體植株和32條染色體的四倍體植株，還有一些染色體重復加倍或有絲分裂不平衡造成的嵌合體。由于大蒜屬于無性繁殖作物，有性繁殖困難，導致其遺傳背景狹窄，新品種選育困難，獲得的嵌合體材料可通過組織培養技術進行大量繁殖，為大蒜新品種選育提供新的途徑（徐啟江 等，2008）。

目前，大蒜多倍體誘導主要通過人工途徑中的化學方法，包括活體誘導法和離體誘導法。與經離體誘導的多倍體相比，直接處理生長點使其萌發的活體誘導法具有操作簡單且適于推廣的優點，但其多倍體誘導率較離體誘導法低。采用直接注射花苞腔初期不定芽生長點與注射隱匿于貯藏葉中的生長點相比，誘導效果更好，但誘變劑的選取，處理材料，誘變劑濃度﹑劑量及處理技術環節上還有待于進一步探索與完善（溫艷斌和程智慧，2012）。

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Studies on Tetraploid Induction of Garlic Bud by Colchicine Injection

XUE Xiao-yan，LIU Shi-qi*，GUO Hui-ping，SUN Ya-li，YU Xin-hui， LIAN Hai-feng

（CollegeofHorticultureScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity，StateKeyLaboratoryofCropBiology，KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrop（HuanghuaiRegion），MinistryofAgriculture，Tai’an271018，Shandong，China）

In order to acquire tetraploid garlic（Allium sativumL.），diploid garlic buds were injected with 0.05%，0.10%，0.15% and 0.20% colchicine，respectively．Then the aerial bulbils in garlic buds were cultured in MS medium combined by different growth regulators．After a regeneration system was constructed，polyploid appraisal was conducted on the root tip．The result indicated that more aerial bulbils were able to germinate on the MS basic culture medium adding 0.05 mg·L-1NAA and 2.0 mg·L-1KT．The aerial bulbils with 4-5 mm diameter had the highest germination rate．The germination rate of ‘Cangshancaosuan’ bulbils was higher than that of ‘Jinsuan No.3’．When the garlic buds were injected with colchicines，the mortality of ‘Jinsuan No.3’ bud was much higher than that of ‘Cangshancaosuan’．The number and size of the formed aerial bulbils were decreased and the rate of doubled chromosome was increased along with the increase of colchicine concentration．The highest doubling rate of ‘Cangshancaosuan’ was obtained by the treatment of injecting the buds with colchicine concentration at 0.20%，and its induction rate was 7.69%．The highest doubling rate of ‘Jinsuan No.3’ was obtained by injecting the buds with colchicine concentration at 0.15%，then its induction rate could reach the highest - 11.76%．

Garlic bud；Aerial bulbil；Tissue culture；Tetraploid；Colchicine

薛小艷，碩士研究生，專業方向：蔬菜栽培生理與分子生物學，E-mail：xuelinyan@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：劉世琦，教授，博士生導師，專業方向：蔬菜栽培生理與分子生物學，E-mail：liusq99@sdau.edu.cn

2013-10-17；接受日期：2013-12-03

“十二五”農村領域國家科技計劃項目（2013BAD01B04）