氮素形態對紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響

葉 芳，劉曉靜，張進霞

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

氮素是植物體內蛋白質、核酸、葉綠素和一些激素等的重要組成部分，是構成作物生長和產量形成的首要因素[1-3]。氮肥對豆科植物根瘤菌侵染、根瘤發育、固氮等都有影響。氮素供應不足時會抑制根瘤的生長發育[4]，從而進一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮。苜蓿作為家畜飼用的重要豆科牧草，可以借助根瘤中的共生固氮菌直接吸收空氣中的分子態氮，但其固氮量遠遠不能滿足苜蓿生長發育對氮的需求，還必須施用氮肥。適量施氮不僅可以促進苜蓿根的分枝，增加根長，提高根重，還能明顯促進紫花苜蓿結瘤固氮、增加紫花苜蓿的鮮干草產量及營養品質[5-7]。因此，適量的施氮肥不僅對苜蓿有一定的增產效果[8，9]，而且對我國畜牧業的可持續發展具有重要意義。

NO3--N和NH4+-N是植物生長過程中主要的兩種礦質氮源，對植物的生長和發育有著重要作用[10]。研究表明，NO3--N可以促進植物根系的長度生長以及表面積和密度的增加[11]，NH4+-N可以促進紫花苜蓿生物量積累和結瘤固氮[12]。與單一的NO3--N或NH4+-N比，將NO3--N和NH4+-N以適度比例混合施用可以促進絕大多數旱作作物生長。Duxbury等[13]報道，苜蓿枝條的高度、單株重量和枝條數均隨NH4NO3施用量的增加而增加。Feil B等[14]研究表明，單一的施用NO3--N或NH4+-N均會引起水稻生物量積累的減少，同時供應兩種形態氮素比供應單一形態氮素更能顯著提高水稻的氮素利用率，促進植物生長。目前，有關氮素對紫花苜蓿影響的研究由來已久，而其對苜蓿生長和生理特性也均有影響，但為了進一步研究氮素形態對“甘農3號”紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，試驗采用砂培法，通過營養液控制氮素形態來對比研究不同外源氮素對“甘農3號”紫花苜蓿盛花期生長及結瘤固氮的影響，以期為紫花苜蓿合理的氮素供應提供理論依據和數據支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試紫花苜蓿品種為“甘農3號”紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，由甘肅農業大學草業學院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理 選取大小均勻，顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，95%乙醇浸泡5 min后，0.1% HgCl2溶液滅菌3 min，無菌水沖洗5～6次，最后用無菌濾紙吸干，備用[15]。

1.2.2 營養液配置 Fahraeus無氮植物營養液Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1000 mL，pH6.5～7.0。Gibson微量元素液H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[16]。

1.3 試驗設計

選用直徑16 cm、高20 cm的花盆，裝入經自來水沖洗再用蒸餾水清洗并經過高溫滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒滅菌種子，播種14 d后進行間苗，每盆保苗50株，然后澆入營養液，置于塑料防雨棚。設3種氮素形態：NO3--N，NH4+-N和混合態氮(NO3--N和NH4+-N按1∶1混合)；根據前期試驗結果[17]設3個氮素水平0、105、210 mg/L(以純氮計，最高濃度為霍格蘭營養液中氮素的濃度，低氮為其倍數)，共7個處理，分別以0、NO3--105、NO3--210、NH4+-105、NH4+-210、NO3-+ NH4+-105、NO3-+NH4+-210表示，每處理重復15次，共105個處理，完全隨機排列。以Fahraeus無氮植物營養液為基本營養液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調節pH為7，結合無氮營養液一同施入。

2013年4月25日播種，每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對生真葉完全展開；之后每周淋澆1次配制營養液，每次500 mL；每7 d用蒸餾水淋洗盆栽1次以防止砂培中鹽分積累，而后澆入新配制營養液。紫花苜蓿生長至三片復葉時，每盆接種新培養的苜蓿根瘤菌液50 mL(中華根瘤菌Sinorhizobiummeliloti)。在盛花期測定紫花苜蓿株高，生物量，莖葉比，根瘤數，根瘤重，固氮酶活性和全氮含量。

1.4 測定方法

株高 用直尺直接測量，每個處理重復30次。

生物量 用濾紙吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下殺青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，稱其干重。每個處理重復6次。

莖葉比 以每個處理各取6株長勢相當的單莖，進行莖葉分離，分別置入烘箱105 ℃下殺青15 min，65～75 ℃烘干至衡重，稱其干重。莖和葉的干重之比即為莖葉比。

統計單株根瘤數，每處理取10株。

根瘤重 將每個單株上摘下的根瘤在電子天平上稱其鮮重，每個處理重復10次。

固氮酶活性 采用乙炔還原法測定[18，19]。稱取0.2 g的新鮮根瘤置于7 mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出0.7 mL空氣，注入0.7 mL乙炔，室溫下反應30 min，待機器穩定后，用微量注射器抽取混合氣體25 μL注入氣相色譜儀(GC)進樣柱中，測定C2H2、C2H4峰值。然后在同樣條件下用標準乙烯測定并繪制乙烯的標準曲線，由此計算根瘤樣品的固氮酶活性。每個處理3次重復。測定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫180 ℃，進樣器150 ℃，FID檢測器170 ℃。氣體壓力N2為0.3 mPa，H2為0.08 mPa，空氣為0.15 mPa。C2H4水平[(μmol/(g·h)] =h·x(樣品峰面積)×C(標準C2H4水平，μmol/mL)/ hs(標準C2H4峰面積)×24.9×t(C2H2反應時間，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含 量采用濃H2SO4-H2O2法測定[20]，每個處理重復3次。

1.5 數據處理

采用Excel 2003軟件進行數據整理，并用SPSS 17.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 氮素形態對紫花苜蓿盛花期株高、地上生物量、地下生物量和莖葉比的影響

氮素形態對紫花苜蓿盛花期的株高、地上生物量和地下生物量均有顯著的影響。在接種根瘤菌并且其他營養供應充分的條件下(表1)，不同氮素形態處理下紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均顯著高于CK(P<0.05)，且隨著氮素水平的增加呈現增大的變化趨勢。但NH4+-N處理下紫花苜蓿的地上生物量卻隨著氮素水平的增加而減小。同一氮素水平下，紫花苜蓿的株高表現為：NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NO3--N培養下次之，NH4+-N培養下的最低，各氮素形態處理間差異顯著(P<0.05)。

地上和地下生物量總體表現為NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N培養下的最低，各氮素形態處理間有顯著差異(P<0.05)，氮素濃度為105 mg/L時，紫花苜蓿的地下生物量表現為NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N。當NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時紫花苜蓿的株高、地上和地下生物量均取得最大值。

隨著氮素水平的增加，紫花苜蓿的莖葉比呈現減小的變化趨勢，在相同的氮素水平下，不同形態氮素處理下紫花苜蓿的莖葉比表現為NO3--N培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N和NH4+-N混合培養下的最低，且差異顯著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿的莖葉比最小，為0.750，此時苜蓿的營養成分最高。

表1 不同氮素形態下紫花苜蓿株高、地上生物量、地下生物量和莖葉比Table 1 Nitrogen forms of the plant height,aboveground biomass,underground biomass and stem/leaf ratio of alfalfa

注：同列不同小寫字母表示數據間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 不同氮素形態下紫花苜蓿盛花期根瘤數、根瘤重和固氮酶活性

不同氮素形態處理下紫花苜蓿盛花期的根瘤數、根瘤重和固氮酶活性均顯著高于CK(P<0.05)，除混合態氮培養下的根瘤重外，紫花苜蓿的根瘤數、根瘤重和固氮酶活性均隨著氮素水平的增加呈現增大的變化趨勢(表2)。在相同的氮素水平下，不同氮素形態處理下紫花苜蓿的根瘤數和固氮酶活性均表現為：NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N培養下的最低，各氮素形態處理間差異顯著(P<0.05)。氮素濃度不同，對紫花苜蓿根瘤重的影響不同，氮素濃度為105 mg/L時，紫花苜蓿的根瘤重表現為：NO3--N+NH4+-N>NH4+-N>NO3--N；氮素濃度為210 mg/L時，則表現為：NH4+-N>NO3--N+NH4+-N>NO3--N，各氮素形態處理間差異顯著(P<0.05)。紫花苜蓿的根瘤數和固氮酶活性均在NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，取得最大值，但根瘤重在NO3--N+NH4+-N的濃度為105 mg/L時取得最大值，由此可見，在盛花期氮素濃度過高會抑制根瘤的生長。

表2 不同氮素形態下紫花苜蓿根瘤數、根瘤重和固氮酶活性Table 2 Nitrogen forms of root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 氮素形態對紫花苜蓿盛花期地上部和地下部全氮含量的影響

各氮素形態處理下紫花苜蓿地上和地下部全氮含量均顯著高于CK(P<0.05)，且隨著氮素水平的增加均呈現增大的變化趨勢。同一氮素水平下，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量均表現為：NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N培養下的最低，各氮素形態處理間差異顯著(P<0.05)。NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿的地上和地下部全氮含量最高，地上部全氮含量較NH4+-N、NO3--N分別增加了0.14%，0.66%，地下部全氮含量較NH4+-N、NO3--N分別增加了0.45%，0.81%，說明NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿氮含量的積累，NH4+-N處理下全氮含量高于NO3--N，二者以一定的比例混合使用最能增加紫花苜蓿植株體內全氮含量。

圖1 不同氮素形態下紫花苜蓿地上部和地下部全氮含量Fig.1 Effects of nitrogen forms on aboveground and underground nitrogen content of alfalfa

3 討論與結論

施氮不僅能提高作物的生物產量[21]和種子產量，同時還能增加紫花苜蓿干物質和氮素積累量[22]，可以明顯改善紫花苜蓿的品質[23]，且苜蓿枝條的高度、單株重量和枝條數均隨NH4NO3施用量的增加而增加。有研究證明，NH4+-N可以使根系明顯變短、加粗，促進側根的形成，從而增強紫花苜蓿營養吸收，促進紫花苜蓿生物量的積累。但董守坤等[24]在大豆的研究上表明，NH4+-N和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生長。試驗表明，盛花期各處理下紫花苜蓿的株高和生物量均顯著高于CK，且隨著氮素水平的增加呈現增大的變化趨勢，也說明施氮能夠促進紫花苜蓿的生長。不同氮素形態處理下，紫花苜蓿的株高表現為NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NO3--N培養下次之，NH4+-N培養下最低；生物量為NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N培養下最低。說明與單一NO3--N或NH4+-N相比，混合態氮最能促進紫花苜蓿的生長。分析原因可能是NO3--N和NH4+-N同時存在于生長的介質中會相互影響彼此的吸收速率及吸收動力，NO3--N可以促進植物對NH4+-N的吸收[25]，與混合態氮相比，單純供應NH4+-N往往會抑制K+和Ca2+的吸收，并帶來氨害，抑制生長[26]；單用NO3--N，亦有不利之處，在還原過程中消耗能量較多，若在弱光條件下，NO3--N吸收有可能受抑制，造成氮素供應不足。Chen等[27]研究也認為，NO3--N和NH4+-N混合營養下植物生長更具優勢。莖葉比是衡量苜蓿品質的重要指標，苜蓿葉蛋白含量非常豐富，莖葉比越小，葉片的比例越高，營養物質含量就越多，適口性就越強，牧草的品質也就越好。張杰等[28]在苜蓿的研究中得出施氮量越多，苜蓿的莖葉比越小。試驗也發現，隨著氮素水平的增加，紫花苜蓿盛花期的莖葉比呈現減小的趨勢，不同形態氮素處理下紫花苜蓿的莖葉比表現為：NO3--N培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N和NH4+-N混合培養下最低。

氮和豆科植物根瘤固氮酶活性、數量、形態結構的關系已有報道[29]。根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指標。試驗發現，不同氮素形態處理下紫花苜蓿盛花期的根瘤數、根瘤重、固氮酶活性和全氮含量均高于CK，表現為NO3--N和NH4+-N混合培養下最大，NH4+-N培養下次之，NO3--N培養下的最低，說明適量的NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿結瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。原因可能是NO3--N和NH4+-N同時存在于生長介質中時，會表現出聯合效應，促進紫花苜蓿結瘤固氮。

綜上所述，NO3--N和NH4+-N均能促進紫花苜蓿盛花期生長和結瘤固氮，但二者混合使用效果最佳，當NO3--N+NH4+-N的濃度為210 mg/L時，紫花苜蓿生長最好。

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