燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發條件研究

張玉霞，趙桂琴，姚 拓，王國基，馬文文

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

燕麥(Avenasativa)是一種抗逆性強、生產潛力較大、品質優良的世界性糧飼兼用作物，全世界已有42個國家種植燕麥，年種植面積約1 300萬hm2，其中95%是皮燕麥。中國主要種植裸燕麥，年種植面積約為100萬hm2，主要集中于我國華北、西北地區[1]。目前，燕麥制品的開發領域已經涉及到食品、化妝品、醫藥、油脂抗氧化劑等多方面，除常見食品燕麥片外，還有燕麥方便食品、燕麥糕點和燕麥乳飲料等[2]。

散黑穗病(Ustilago)是我國燕麥產區發生最普遍和嚴重的真菌性病害，主要為害花器，病株始終直立，根系不發達，分蘗很少，既降低了燕麥種子產量，也影響秸稈的產量和品質[3]。該病在華北、西北的一些省區，發病率通常超過10%，河北、山西、內蒙古、甘肅等省最高發病率曾達46%～90%。據不完全統計，內蒙古全區每年糧食產量損失2.5×107～3.5×107kg。1981年，河北省廢?？h燕麥散黑穗病的發病面積達2.14萬hm2，占該縣裸燕麥播種面積69.1%，其中，7 933 hm2發病率在10%～13%，全縣糧食產量損失1.5×106kg[4]。

燕麥散黑穗病病菌(Ustilagoavenae)以厚垣孢子附著在燕麥種子表面或以菌絲潛伏在種子與穎殼之間甚至種皮內越冬，引起初侵染，土壤和肥料傳播的可能性較小[5]。目前，燕麥散黑穗病已成為當前嚴重影響其產量和品質的主要病害，甚至成為了一種毀滅性病害。冬孢子能否良好地萌發是該病害能否發生的關鍵，了解其在自然環境中的萌發適宜條件，在燕麥生產中盡量避免為其散黑穗病菌冬孢子萌發提供相適應的條件，可有效防止該病害的發生。燕麥冠銹、葉銹及白粉病等均被大量研究[6]，但是，該病害病原菌冬孢子萌發條件報道較少。通過測定燕麥散黑穗病菌冬孢子在不同條件下的萌發率，確定其萌發條件，可為該病害科學防治提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試燕麥散黑穗病菌冬孢子由甘肅省農業科學院甘谷試驗站提供。

1.2 方法

1.2.1 冬孢子懸浮液配制與孢子萌發統計 挑取少量燕麥散黑穗病菌冬孢子粉加入適量無菌蒸餾水，振蕩搖勻、使孢子團充分散開即制得冬孢子懸浮液。冬孢子懸浮液濃度控制在低倍鏡下可見病菌孢子數100。冬孢子萌發統計方法采用顯微鏡下檢查，淡黃色為未成熟的冬孢子，不能萌發，不予統計。以芽管長度超過冬孢子直徑1/2作為其萌發標準[7]。每時間段各處理檢查至少200個以上冬孢子[9]。

1.2.2 疏親水界面對冬孢子萌發的影響 用移液槍取冬孢子懸浮液，分別置于疏水(滅菌載玻片、燕麥葉片正面)、親水(含有水瓊脂培養基的表面、濕潤的濾紙)界面上，標記接菌點，置于25 ℃培養箱中培養。分別于4，8，12，24 h后鏡檢冬孢子萌發情況，計算萌發率，每處理3次重復。

冬孢子萌發率(%)=[冬孢子萌發數/(冬孢子萌發數+未萌發孢子數)]×100%[10]。

1.2.3 溫度對冬孢子萌發的影響 將配制的冬孢子懸浮液分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫下保濕培養，分別于第4，8，12，24 h后在顯微鏡下觀察記錄冬孢子萌發情況，每處理重復3次。

1.2.4 濕度對冬孢子萌發的影響 用無菌水將冬孢子粉制成冬孢子懸浮液，置于載玻片上自然風干，置于相對濕度(RH)為40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的恒溫箱中25 ℃恒溫培養，4，8 和12 h后鏡檢冬孢子萌發情況，每處理重復3次。

1.2.5 光照對冬孢子萌發的影響 將冬孢子粉制成的孢子懸浮液懸滴于水瓊脂平板上，在25 ℃下以日光燈模擬自然光連續光照、連續黑暗、光暗交替各12 h，光照8 h黑暗16 h，光照16 h黑暗8 h，培養24 h后，鏡檢各處理孢子萌發情況，每處理重復3次。

1.2.6 pH對冬孢子萌發的影響 用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉配制pH4、5、6、7、8、9的緩沖溶液，再以此溶液分別配制成對應pH的冬孢子懸液，將各處理冬孢子懸液懸滴于水瓊脂培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，分別于第4，8和12 h后鏡檢冬孢子萌發情況，每處理重復3次[11]。

1.2.7 碳、氮源對冬孢子萌發的影響 用6種碳源(1% 蔗糖、1% 葡萄糖、I% D-木糖、1% 甘露醇、l% 可溶性淀粉、1% 麥芽糖)和6種氮源(1% 乙酸銨、1% 氯化銨、1% 甘氨酸、1% 尿素、1% 蛋白胨、1% 硫酸銨)溶液制備冬孢子懸浮液，以無菌水為對照。將各處理冬孢子懸液懸滴于水瓊脂培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，12 h后鏡檢冬孢子萌發情況，每處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 冬孢子及冬孢子萌發形態

燕麥散黑穗病菌冬孢子團黑褐色，冬孢子(圖1-A)球形或近球形，橄欖褐色。冬孢子萌發以直接產生芽管(圖1-B)為主，常有分枝(圖1-C)，在萌發時可以產生次生小孢子。

圖1 燕麥散黑穗病菌冬孢子形態(A)及萌發形態(B、C)Fig.1 Morphology of teliospores (A) and germinating teliospores (B、C) of Ustilago avenae注:A.冬孢子(10×40);B.冬孢子4 h時萌發狀態(10×40);C.冬孢子12 h時萌發狀態(10×40)

2.2 疏親水界面對燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

散黑穗病菌冬孢子在燕麥葉片和濾紙上均不能萌發；水瓊脂培養基上的萌發率最高，4 h時開始萌發，萌發率為19.84%；在12 h時萌發率達到76.57%(圖2)，且芽管開始出現分枝。載玻片上冬孢子在12 h時的萌發率不超過5%，極顯著低于水瓊脂培養基的處理。結果表明，冬孢子在不同疏親水界面上萌發率差異顯著，且冬孢子萌發受親水界面的誘導。

2.3 不同溫度對燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發溫度范圍10～35 ℃，但低溫和高溫影響冬孢子萌發率，5，40 ℃處理下的冬孢子始終不萌發(圖3)。在10～25 ℃，冬孢子萌發率隨溫度升高而增加，25 ℃處理的冬孢子萌發率最高；低于10 ℃與高于35 ℃的各處理間冬孢子萌發率沒有顯著差異(P>0.05)。在4個試驗時間段內，4 h時冬孢子萌發率在0.94%～15.28%；8 h時，35 ℃處理的散黑穗病菌冬孢子開始萌發，萌發率為1.07%，25 ℃處理萌發率最高，為56.13%；12 h時，10 ℃處理下的孢子開始萌發，20與25 ℃處理的芽管粗壯且開始出現分枝，30 ℃處理的冬孢子萌發率較低，芽管細長；24 h時，5 ℃處理的散黑穗病菌冬孢子開始萌發，而25 ℃處理下其冬孢子萌發率達到91.51%。結果表明，溫度越低，散黑穗病菌冬孢子萌發所需時間越長。

圖2 疏親水界面下冬孢子萌發Fig.2 Effect of lyophobic and hydrophilic interface on teliospore germination

注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

圖3 不同培養溫度下冬孢子萌發Fig.3 Effect of temperature on teliospore germination

2.4 不同濕度對燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

冬孢子在相對濕度(RH)≤80%時始終不萌發；RH為90%的冬孢子12 h時有萌發，且萌發率均小于5%；RH為95%處理的散黑穗病菌冬孢子8 h時開始萌發，并在12 h時萌發率達到6.91%；RH為100%處理的冬孢子4 h時開始萌發，8h時萌發率超過5%，12 h時萌發率為7.84%；但整體來說所有處理萌發率均小于10%，與水瓊脂培養基上冬孢子萌發率差異顯著(表1)；所有萌發的冬孢子芽管均無分枝。

表1 不同濕度處理下冬孢子萌發Table 1 Effect of humidity on teliospore germination

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.5 不同光照時間對散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

光照8 h處理的冬孢子萌發率高于其他處理，并與其他處理存在顯著差異(圖4)；光照24 h的冬孢子萌發率僅次于光照8 h的處理，但光照24、16、12、0 h處理間的散黑穗病菌冬孢子萌發率均未達到顯著差異(P>0.05)，即表明光照時間對冬孢子萌發的影響不大。

圖4 不同光照處理下冬孢子萌發Fig.4 Effect of light illumination time on teliospore germination

2.6 pH對散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

燕麥散黑穗病菌冬孢子對pH值的要求較低，在較大的pH范圍內都能萌發，酸堿都能影響冬孢子萌發率，但酸性條件影響作用更顯著(圖5)。其中，pH為4時冬孢子萌發率最高，隨著pH的升高，冬孢子懸浮液堿性增強，冬孢子萌發率呈現下降趨勢，pH為9時冬孢子萌發率最低；pH為8和9時冬孢子萌發率顯著低于pH為4、5、6、7的處理(P<0.05)。由此可見，酸性條件有利于冬孢子萌發，而堿性條件對冬孢子萌發有抑制作用。

圖5 不同pH下冬孢子萌發Fig.5 Effect of pH on teliospore germination

2.7 不同碳、氮源對燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發的影響

在葡萄糖溶液中，散黑穗病菌冬孢子萌發率高達79.38%，與可溶性淀粉及對照之間無顯著差異(表2)；D-木糖、麥芽糖、甘露醇溶液中的冬孢子萌發率顯著低于對照，說明此3種溶液對冬孢子萌發有抑制作用。在尿素和蛋白胨溶液中的冬孢子萌發率顯著高于對照，而甘氨酸溶液中的冬孢子萌發率顯著低于對照，說明不同氮源對冬孢子萌發影響各異。

表2 不同碳、氮源下冬孢子萌發Tab.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on teliospore germination

3 討論和結論

不同病菌最適培養條件不盡相同[8]。研究結果表明，燕麥散黑穗病菌冬孢子的萌發與外界環境條件密切相關，溫度、濕度和pH對冬孢子萌發均有直接影響。冬孢子在親水和軟水瓊脂培養基上具有較高的萌發率，在較親水和硬的載玻片上萌發率較低，冬孢子萌發受親水性和軟的表面的誘導，而徐嬋等[10]對美味黑粉菌(Ustilagoesculenta)冬孢子萌發條件研究結果是美味黑粉菌冬孢子萌發受疏水界面的誘導，出現這種差異的原因可能是試驗材料致病菌不同。

燕麥散黑穗病菌冬孢子適宜萌發溫度20～25 ℃，溫度偏高或偏低都不利于孢子萌發，與前人研究的稻粒黑粉病菌(Neovossiahorrida)[9-11]、白頭翁黑粉病菌(Urocystispulsatillae)[12]冬孢子萌發條件中溫度試驗結果相似。冬孢子萌發對濕度的要求較高，只有在RH>90%時冬孢子才可以萌發，且萌發率不高，與樊永軍等[13]、劉正坪等[14]的研究結果一致；光照對冬孢子萌發的影響不大，只有光照8 h處理的冬孢子萌發率與其他處理存在顯著差異，其他各處理之間均無顯著差異；適宜冬孢子萌發的pH為4～7，堿性條件可以抑制孢子的萌發，這一結果與前人在白頭翁黑粉病(載玻片)[12]、小麥散黑粉病(水瓊脂培養基)[14]和甘蔗黑穗病(載玻片)[16]上報道的結果基本一致，而陳勝軍等[11]認為，稻粒黑粉病冬孢子在PSA培養基上pH為7時萌發率最高，此種差異可能是由于孢子萌發所用培養基和致病菌不同造成的。

最適碳源為葡萄糖，此結果與前人報道的結果不同，有學者認為葡萄糖可以促進蘆葦黑粉病冬孢子萌發[15]，吳偉懷等[16]認為蔗糖對甘蔗黑穗病冬孢子萌發的促進作用大于葡萄糖，而本試驗中的蔗糖對燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發有抑制作用，此種差異可能與菌種有關；同時，適宜燕麥散黑穗病冬孢子萌發的氮源為蛋白胨和尿素，說明有機N素比無機N素更有利于冬孢子的萌發[13]。也有試驗證明氮素過多能使稻粒黑粉病加重[17]。

該試驗的散黑穗病菌冬孢子來源單一，休眠時間較短，越冬處理方式單一，是否不同地域的冬孢子萌發條件一致、休眠時間是否影響孢子萌發、燕麥病粒處理不當是否可以促進冬孢子萌發等問題還有待進一步的研究。所有冬孢子萌發試驗都是在氧氣充足的條件下進行，是否厭氧條件可以抑制冬孢子萌發也有待進一步的研究。施用PGPR菌肥可促進燕麥根長、根系干重及根體積等根系性狀的改善[18]，是否可通過施用菌肥增強燕麥抗病能力也同樣值得一試。

燕麥散黑穗病菌冬孢子萌發受親水界面的誘導，在水瓊脂培養基上萌發率可達76.57%；適宜萌發的溫度20～25℃；對濕度要求很高，RH≥90%時開始萌發，萌發率<10%；光照對孢子萌發的影響不明顯；最適pH為4～7，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。

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