外源NO對NaCl脅迫下扁蓿豆種子萌發和幼苗生長的影響

魚小軍，徐長林，景媛媛，陳陸軍，楊海磊，張建文，牛鑫斌

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心,甘肅 蘭州 730070)

土壤鹽漬化是影響農業生產和生態環境的全球性問題[1]，全世界約有9.5×108hm2的鹽漬土，在中國每6.7×107hm2耕地中就有10%的鹽漬化土壤[2]。土壤中高濃度的鹽會導致植物體內離子紊亂、造成高滲透脅迫，導致植物生長減緩，直接影響到植物的產量[3]。鹽害已成為制約牧草生產的主要逆境因素之一，提高牧草耐鹽性是克服土壤鹽漬化的一條重要途徑[4]。一氧化氮(NO)是廣泛分布于生物體的一類氣體生物活性分子，屬于活性氧范疇，通過酶促和非酶促途徑產生，具有毒害和保護生物細胞的雙重性[5]。NO在植物體內廣泛存在，通過一氧化氮合酶(NOS)和硝酸還原酶(NR)合成，并與植物的抗病和對各種脅迫的應答，以及細胞編程性死亡有關[6,7]。已有研究表明，NO廣泛存在于植物組織中，并參與種子萌發、植株生長及對各種逆境脅迫的應答等過程[8]，能明顯減緩鹽脅迫對玉米(Zeamays)[5，9]、黑麥草(Loliumperenne)[10]、沙蔥(Alliummongolicum)[11]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[12]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[13]等種子萌發和幼苗生長的傷害。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)又名花苜蓿、野苜蓿，屬豆科苜蓿屬植物，廣泛分布于我國甘肅、青海、新疆、內蒙古、山西、河北、遼寧、吉林及黑龍江等地，是一種生態適應性廣、抗旱抗寒、耐貧瘠、營養價值較高的優良野生豆科牧草[14-16]。扁蓿豆可以與羊草(Leymuschinensis)等禾本科牧草建立混播栽培草地，在改良草地、建立人工草地、防治水土流失等方面具有重要意義，尤其在寒冷半干旱、土壤貧瘠區引種具有特殊意義[16]。目前，對扁蓿豆的研究集中于分布、形態、生物學特性以及引種選育等方面[16-20]，對于施加外源NO來緩解鹽堿對扁蓿豆種子的萌發和幼苗生長的傷害報道較少。為此，研究以150 mmol/L NaCl作為鹽脅迫條件，研究了不同濃度的外源NO對扁蓿豆種子萌發和幼苗生長的影響，探討提高扁蓿豆種子萌發期耐鹽性的途徑，以期為扁蓿豆的栽培提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗于2013年3～5月在甘肅農業大學草業學院實驗室進行，供試扁蓿豆種子為自選8號新品系。

1.2 研究方法

試驗設置7個處理，S0(0% SNP+0 mmol/L NaCl)、S1(0% SNP+150 mmol/L NaCl)、S2(0.01% SNP+150 mmol/L NaCl)、S3(0.05% SNP+150 mmol/L NaCl)、S4( 0.1% SNP + 150 mmol/L NaCl)、S5(0.5% SNP+150 mmol/ L NaCl)和S6(SNP 1.0%+150 mmol/ L NaCl)。

選取飽滿均勻一致的扁蓿豆種子，用砂紙打磨，以種皮出現紋痕為好。然后吸取配置好的溶液10 mL導入鋪有濾紙的培養皿，后將處理好的扁蓿豆種子置入培養皿，每皿50粒，重復3次。為保證處理濃度穩定，每隔2 d更換1次處理液。每天觀察發芽情況，處理第8 d取樣測定芽長和根長，每皿隨機測定10株。

發芽率(GP)=100×GN/SN

發芽指數(GI)=∑ (Gt/Dt)[21，22]

活力指數(VI)=GI×S[21，22]

式中：GN為總的種子發芽數，SN為供試種子總數；Gt為在t日的發芽數，Dt為相應的發芽天數；S為幼苗長度。

1.3 數據處理

所有數據用平均值±標準誤差表示，采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用Microsoft Excel 2003軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫下NO對扁蓿豆種子發芽率的影響

單獨鹽脅迫(S1)顯著抑制了扁蓿豆種子的發芽率(P<0.05)(圖1A)。在鹽脅迫下，處理S3(0.05%SNP+150 mmol/L NaCl)處理后扁蓿豆種子發芽率為86%，顯著高于S1(46%)、S2(0.01%SNP+150 mmol/L NaCl)(28%)、S4(0.10%SNP+150 mmol/L NaCl)(52%)、S5(0.50%SNP+150 mmol/L NaCl)(27%)和S6(1.00%SNP+150 mmol/L NaCl)(35%)處理(P<0.05)，但和S0(83%)(0%SNP +0 mmol/L NaCl)處理下的發芽率無差異顯著(P>0.05)。

150 mmol/L的NCl溶液的鹽脅迫(S1)處理顯著抑制了發芽速率，降低了扁蓿豆種子的發芽指數(P<0.05)(圖1B)。S2(0.01%SNP+150 mmol/L NaCl)、S3(0.05%SNP+150 mmol/L NaCl)、S4(0.10%SNP+150 mmol/L NaCl)、S5(0.50%SNP+150 mmol/L NaCl)和S6(1.00%SNP+150 mmol/L NaCl)處理中，S3處理下的發芽指數最高為24，顯著高于S1(6)處理和其他處理；其他處理均未能顯著提高扁蓿豆種子的發芽指數(P>0.05)。

圖1 外源NO對鹽脅迫下扁蓿豆種子發芽率(A)和發芽指數(B)的影響Fig.1 The effect of NO on the germination percentage (A) and germination index (B) of Medicago ruthenica seeds under NaCl stress注：不同小寫字母表示5%水平差異顯著，下圖同

圖2 外源NO對鹽脅迫下扁蓿豆幼苗芽長和根長的影響Fig.2 The effect of NO on the plumule (A) aNd radicle (B) length of Medicago ruthenica seedling under NaCl stress

S1處理顯著抑制了扁蓿豆種子的發芽指數，降低了發芽速率(P<0.05)(圖1B)。S2、S3、S4、S5和S6處理中，僅有S3處理顯著增加了扁蓿豆種子的發芽指數(P<0.05)，其他處理均未能顯著提高扁蓿豆種子的發芽指數(P>0.05)。

2.2 NaCl脅迫下NO對扁蓿豆幼苗生長的影響

單獨鹽脅迫(S1)顯著抑制了扁蓿豆種苗幼芽的生長(P<0.05)(圖2A)。S2、S3、S4、S5和S6處理中，僅有S3處理顯著促進了扁蓿豆種苗幼芽的生長(P<0.05)，其他處理均未能顯著提高扁蓿豆種苗幼芽的生長(P>0.05)。在鹽脅迫下，S3處理下扁蓿豆幼芽長度長于S0處理，兩者皆顯著高于其他處理(P<0.05)。

單獨鹽脅迫(S1)顯著抑制了扁蓿豆種苗幼根的生長(P<0.05)(圖2b)。S2、S3、S4、S5和S6處理中，僅有S3處理顯著促進了扁蓿豆種苗幼根的生長(P<0.05)，其他處理均未能顯著提高扁蓿豆種苗幼根的生長(P>0.05)。S3處理下扁蓿豆幼根長度長于S0處理，兩者皆顯著高于其他處理(P<0.05)。

2.3 NaCl脅迫下NO對扁蓿豆種苗活力指數的影響

單獨鹽脅迫(S1)顯著抑制了扁蓿豆種苗活力指數(P<0.05)。S3處理顯著促進了扁蓿豆種苗的活力指數(P<0.05)，其他處理均未能提高扁蓿豆種苗活力指數(P>0.05)(圖3)。

圖3 外源NO對鹽脅迫下扁蓿豆種子活力指數的影響Fig.1 The effect of NO on the vigor index of Medicago ruthenica seeds under NaCl stress

3 討論與結論

鹽脅迫會降低種子的發芽率，發指數和幼苗的生長[23]。NO是在植物體內廣泛存在的一類氣體生物活性分子，可以減少非生物脅迫下植物體內活性氧(ROS)的積累，緩解各種脅迫造成的氧化損傷，從而增強植物的適應能力[24]。有研究表明，外源NO供體硝普鈉能顯著促進滲透脅迫下小麥種子的萌發[25]，可以提高水稻幼苗的耐鹽性、提高鹽分脅迫下玉米幼苗的干物重積累速率[26，27]。鹽脅迫對種子影響機理主要有2個方面，一是滲透作用，植物細胞內滲透勢大于細胞外滲透勢，細胞失水致使植物缺水形成生理干旱，二是離子毒害作用，Na+等離子滲入細胞后使原生質凝集和葉綠素被破壞，蛋白質合成受到抑制，產生丁二胺、戊二胺等[28，29]。已有研究已經發現，NO提高植物耐鹽性的機理一方面與其能提高植株的抗氧化能力有關，另一方面也與其能調節植物離子平衡相關[30-33]。試驗結果表明，外源NO在一定程度上緩解了鹽脅迫對扁蓿豆幼苗的發芽率、芽長和根長的影響，但存在濃度效應，適宜濃度(0.5 mmol/L)的NO處理才表現出對鹽脅迫的緩解效應；另外，NO具有毒害和保護生物細胞的雙重性[5]，因此，過低和過高濃度的NO無緩解效應。

外源 NO供體SNP對鹽脅迫下種子萌發和幼苗生長的調節作用可能還需要葡萄糖和果糖信號的參與[29]，種植于土壤的種子，包括溫度、水分及土壤理化和酶學性質都對其萌發產生重要影響[23]。因此，扁蓿豆種子萌發期耐鹽能力的調控及機理還有待于進一步研究。

外源NO對NaCl脅迫下扁蓿豆種子的萌發和幼苗的生長緩解具有劑量效應，以0.05 mmol/L的NO處理效果最好，顯著提高了扁蓿豆種子的發芽率、發芽指數、芽長、根長和活力指數。

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