藏藥余甘子對大鼠CYP2C9活性的影響

青海大學醫學院，青海 西寧 810016

藏藥余甘子對大鼠CYP2C9活性的影響

段雅彬姚星辰李向陽*

青海大學醫學院，青海 西寧 810016

目的分析藏藥余甘子對CYP2C9酶活性的影響。方法對照組灌胃給予生理鹽水，實驗組灌胃給予余甘子。采用探針藥物法評價CYP2C9的活性，探針藥物以及代謝產物的濃度用HPLC測定。結果對照組和實驗組大鼠CYP2C9活性分別為0.083±0.042和0.100±0.049 ，兩組數據差異無統計學意義。結論余甘子對大鼠CYP2C9的活性無影響。

藏藥；余甘子；CYP2C9

余甘子為大戟科葉下珠屬植物，在《藏藥標準》所載的290種藏藥成藥中，含余甘子的有 72 種，占總數的25%。余甘子有防癌作用、抗誘變、抗致畸、抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝、 抗潰瘍、免疫調節作用[1]。并且有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效[2]。CYP2C9是P450酶系第二亞家族中的一個重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20%，約有16%的臨床藥物由CYP2C9負責代謝，如苯妥因，格列苯脲，雙氯芬酸，氯沙坦等。但余甘子對其他復方制劑影響的研究尚未見報道，本文以CYP2C9為研究對象，用探針藥物[3-5]來分析藏藥余甘子對該酶活性影響，為藏藥余甘子臨床用藥和配伍機制提供一定的參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津)；N2000型色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所)；XW-80A旋渦混合器(上海精科有限公司)；TGL-16B高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；各種常規儀器等。

1.1.2 藥品與試劑 余甘子(西寧中藏藥材批發市場購買，經青海大學醫學院魏全嘉教授鑒定)；苯妥英鈉(東京化成工業株式會社，批號：GF01-FD)；4′-羥化苯妥英(Sigma公司，批號：00213DG)；烏拉坦(國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20090811)；甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純

1.1.3 實驗動物 Wistar大鼠20只，清潔級，雌雄各半，體質量(200±20)g，由蘭州大學醫學實驗中心提供，合格證號為14-006。飼養溫度(23±2)℃，照射時間12 h/d(7：00～19:00)，飼養一周后進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組 將大鼠分為對照組、實驗組共2組，每組10只，雌雄各半。對照組灌胃給予生理鹽水(5 ml/kg)，連續3天。實驗組灌胃給予余甘子提取液(5 ml/kg)，連續3天。第4天對照組和實驗組灌胃給予探針藥物苯妥英鈉(15 mg/kg)。

1.2.2 余甘子提取液的制備 取干燥余甘子并精密稱取100 g，加入水 1 000 ml浸泡30 min，加熱至沸騰，回流50 min，過濾，蒸發濃縮，使其質量為0.4 g/ml。

1.2.3 對照品溶液配制 精密稱取4′-羥基苯妥英5 mg，置5 ml 量瓶中，加入純凈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得4′-羥基苯妥英貯備液(1 mg·ml-1) 。取此液0.5 ml置5 ml 量瓶中，加入純凈水定容，即得100 μg·ml-14′-羥基苯妥英水溶液；依次稀釋成10、1 μg·ml-1的溶液。按相同方法配制得100、10、1 μg·ml-1的苯妥英鈉水溶液。

1.2.4 樣本采集 對照組和實驗組給予苯妥英鈉12小時后采集血液，分離血清，冰箱冷凍保存待測。

1.2.5 血漿樣品處理 從冰箱中取出樣品在室溫下解凍，渦旋30秒，吸取120μl血清樣品加40μl 30%HCLO混旋1 min，TGL-16B高速離心機 16 000 r/min離心10 min，取上清液10(l采用高效液相色譜進樣分析。

1.2.6 酶活性評價 大鼠給予苯妥英鈉后測定12 h血清中苯妥英鈉(PHT)和代謝產物4′-羥基苯妥英(HPPH)，以HPPH/PHT的濃度比值評價CYP2C9的活性。

1.2.7 色譜條件 采用反相高校液相色譜法測定血清中苯妥英鈉和代謝產物的濃度。色譜條件 PHT和HPPH：流動相為乙腈-水-冰乙酸-三乙胺 (40∶60∶0.3∶0.3, v/v)，色譜柱為Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5(m)，流速為1.0 ml·min-1，檢測波長為220 nm；進樣量10μl。在此條件下將一定濃度的苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的對照品溶液進樣10μl，得對照品溶液色譜圖(Figure 1 A)；取大鼠空白血清，按樣品處理項下方法操作，進樣10μl，得空白血清色譜圖(見Figure 1 B)；將一定濃度的苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的對照品溶液加入空白血清中，依同法操作，得相應色譜圖(Figure 1 C)；取給藥12 h后的血清樣品，依同法操作，得給藥后的色譜圖(Figure 1 D)；其中苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的峰形良好，基線平穩；結果表明，血清中的內源性物質不干擾苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的測定。

1.2.8 回收率及精密度 配制低、中、高濃度的標準血清樣品 (苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英均為1、6、20 μg/ml)按“樣品預處理”項下操作并進樣分析，測定值與相同濃度對照品溶液測定值相比計算回收率(n=5)；同日和連續5 日各處理5 份樣品, 求日內RSD和日間RSD。精密度與回收率結果分別見表1。

表1 精密度及回收率考察結果(n=5)

1.2.9 數據處理 所有數據以mean±SD表示，SPSS13.0統計軟件進行分析處理,采用兩獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

采用前述建立的HPLC法測定對照組與實驗組給藥后的CYP2C9酶活性，對照組與實驗組給藥后的CYP2C9酶活性評價。由表2可知，對照組與實驗組大鼠CYP2C9的活性無統計學意義，余甘子對CYP2C9的活性無影響。

表2 對照組與實驗組CYP2C9酶活性

3 討論

基于P450的中藥配伍機制研究文獻報道較多，劉琳娜[6]等驗證了甘草水煎液對P450活性有一定增強作用；呼自順[7]等研究表明黃芩對CYP2C9的活性有增強作用，說明黃芩對其他藥物的代謝起到減毒防毒的作用。本文研究顯示余甘子雖對CYP2C9活性無影響，但對其它P450各亞酶活性影響如何，哪類主要成分影響酶活性，當余甘子和酶誘導劑或酶抑制劑合用時又會產生何種結果，值得進一步研究。

葉亞琳[8]等通過采用CO還原差示光譜法測定CYP450的含量來說明對酶活性的影響，只能驗證P450的活性，而探針藥物法(苯妥英鈉)可以特異性評價CYP2C9活性，李芹[9]等采用基因法研究P450酶活性，本研究采用探針藥物法評價酶活性，并且比基因法要簡便，快捷。本實驗采用了Liehrospher C18色譜柱和乙腈-水-冰乙酸-三乙胺(40∶60∶0.3∶0.3，v/v)為流動相，進行等度洗脫，苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英可以在10 min中內完成測定，比文獻報道[10]的分析時間明顯縮短。

[1]侯開衛.余甘子化學成分及其在民族民間傳統醫藥中的應用[J].中國民族民間醫藥雜志，2002，11(6)：345.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：142.

[3]李向陽，劉永年，袁明，等.高原低氧對藥物代謝酶CYP2C9和2C19活性及蛋白表達的影響[J].藥學學報，2012，47(2)：188-193.

[4]樊慧蓉，和凡，劉昌效.“Cocktail”探針藥物法評價肝細胞色素P450酶同工酶影響的研究進展[J].中國藥學雜志，2006，41(14)：1045-1048.

[5]扈金萍，閆淑蓮，唐靜成，等.Cocktail探針藥物評價姜黃對肝細胞色素P450 酶的影響[J].首都醫科大學學報，2004，25(4)：427-430.

[6]劉琳娜，王汝濤，王慶偉，等. 甘草水煎液對大鼠肝微粒體細胞色素P450酶活性的影響[J].中國臨床藥理學與治療學，2010，15(12)：1330-1333.

[7]呼自順，王琤，張弋，等.Cocktail探針藥物評價黃芩對大鼠CYP450活性的影響[J].中國醫院藥學雜志， 2010，30(2)：108-110.

[8]葉亞琳，張貞良，曹洋，等. 雷諾嗪對大鼠肝微粒體蛋白質及細胞色素P450的影響[J].廣東藥學院學報，2007，23(1)：53-55.

[9]李芹，王睿，許力，等.基因芯片法測定中國人群細胞色素P4502D6的基因多態性[J].中國臨床康復，2006，10(24)：39-41.

[10]馬春來，焦正，應寅清，等.反相高效液相色譜法同時測定人血漿中苯妥英鈉、苯妥英鈉及其主要代謝產物4′-羥苯妥英的濃度[J].中國藥學雜志，2008，43(22)：1743.

TheeffectofTibetanmedicinephyllanthusemblicaontheactivityofCYP2C9

Duan Ya-bin YAO Xing-chen LI Xiang-yang

Medical College of Qinghai university,Xining 810016,China

ObjectiveTo analysis the effect of Tibetan medicine Phyllanthus emblica on the activity of CYP2C9.MethodsRats in control and experimental group were administrated orally saline and Phyllanthus emblica,respectively.The activity of CYP2C9 was evaluated by the probe drugs method,And probe drugs and metabolites concentration determined by HPLC.ResultsThe rats CYP2C9 activity in control group and experimental group were 0.083±0.042 and 0.100±0.049,respectively.There was no significant difference between two groups.Conclusionthe Phyllanthus emblica had no significant effect on the activity of CYP2C9 in rats.

Tibetan medicine；Phyllanthus emblica L；CYP2C9

青海省自然科學基金(2014-Z-909)。

段雅彬(1990-)，男，在讀碩士研究生。

李向陽，Email：qhmclxy@163．com

R29

A

1007-8517(2014)11-0008-03

2014.04.03)