玉米專用菌肥研制及其部分替代化肥施用對玉米生長的影響

王國基，張玉霞，姚 拓，柴 強，馬文彬，馬文文

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農業大學 農學院，甘肅 蘭州 730070)

玉米(Zeamays)作為人類口糧、牲畜飼料和工業生產原料發揮著舉足輕重的作用，種植面積僅次于小麥和水稻，全世界對玉米的需求量逐年呈現增長趨勢。近年來，我國玉米生產發展勢頭良好，玉米增產對糧食產量增加的貢獻率達49.4%[1]，為滿足其生存和高產所需的氮、磷等營養元素,施用工業化肥一直被認為是實現這一目的的主要途徑。中國占世界10%的耕地卻消費了世界1/3的化肥，單位面積施肥量是世界平均水平的3倍[2]。大量施用化肥帶來的負面效應正在突顯，如成本高、對非再生能源消耗大、污染空氣、土壤及水質、威脅食品安全、破壞土壤結構及微生物區系及多樣性等[3]。現代農業在追求糧食高產的同時工作重心已經向糧食安全問題轉移，其中，尋求化肥替代品已成為一條解決途徑。玉米要達到高產、穩產，除外界影響因素，內在因素也起著重要作用，如玉米干物質積累絕大部分來自葉片[4]。可以認為作物經濟產量的高低是由生物產量即干物質積累量所決定，因此,掌握玉米的干物質積累對提高產量具有重要意義[5]。

近年來，國內外研究表明，植物根際存在著大量的有益菌，最早為人們所熟知的是固氮菌(Azotobacterspp.)[6]。其菌有從空氣中直接固定氮氣的能力，部分兼有解磷、分泌植物生長調節物質、促進植物生長等功能[7]。利用這類菌的優良特性研制生物菌肥，不僅可以發揮肥效作用，同時能活化土壤、改善土壤結構，還可以減少化肥購入成本以及對非再生資源的消耗。經國內外學者研究，從重要作物如水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)和棉花(Anemonevitifolia)等作物根際篩選出大量優良促生菌株(PGPR)，部分菌株已用于商業化菌肥生產，在農業生產中發揮著重要作用。榮良燕等[11]利用分離篩選出的優良PGPR 菌株制作成菌肥，測定菌肥替代20%～30%化肥施用對玉米生長的影響，結果表明，施用菌肥替代部分化肥對玉米的株高、地上植物量、穗長和經濟產量均有提高，且化肥減量和促進增產的直接經濟效益分別為620.1元/hm2，2 291.4元/hm2。段秀梅等[12]測定了兩株解磷菌對玉米苗生長的影響，結果表明，混接解磷菌在玉米株高和干重方面較對照分別增加了35.5%和28.9%。張堃等[13]報道了在高寒地區利用聯合固氮菌肥+半量氮肥處理與全量氮肥對比，試驗表明青稞苗期的株高、地上生物量、主根長、根體積、粗蛋白等并無顯著差異，說明菌肥配施半量氮肥表現出與全量化肥相似的促生效果，可以節省一半氮肥，降低化肥投入成本。但促生菌肥在田間的應用效果存在著很大差異，其主要原因是試驗區氣候特點、宿主植物、促生菌種類和土壤狀況等綜合因素導致菌肥在田間的效果。因此，如何能使菌肥的田間混接促生效果達到最佳，還需要進一步的深入研究。對前期從玉米根際分離的促生菌株進行篩選，獲得優良菌株并研制玉米專用菌肥，測定其部分替代化肥對玉米葉面積與干物質積累的影響，在保證玉米不減產的條件下，減少化肥投入，尋求玉米專用菌肥與化肥之間的最佳配比，為循環農業中減少化肥施用提供理論依據和技術支撐。

1 材料和方法

培養基為LB[14]；NFM[14]；Pikovaskaia’s[14](PKO)；CCM[14]。

1.1 供試菌株

分離自白銀、定西及武威等玉米種植區玉米根際的38株菌株。

1.2 優良菌株特性測定

測定供試菌株培養特性、固氮酶活性、溶磷量及分泌植物生長素等指標，篩選優良菌株，為研制玉米專用菌肥提供菌種資源。

1.2.1 優良菌株固氮酶活性測定 利用NFM培養基將供試菌株分別接種于盛有5 mL 半固體NFM 培養基的血清瓶中( 每菌株6個重復)，按文獻[15]的方法，結合氣相色譜儀，利用乙炔還原法確定菌株是否有固氮酶活性，并計算固氮酶活性。

式中：hx為樣品峰面積(cm2)；hs為標準C2H4峰面積(cm2)；C為標準C2H4濃度(nmol/mL)；V為培養容器體積(mL)；t為樣品培養時間(h) ；N為產生的C2H4濃度( nmol/mL·h) 。

1.2.2 優良菌株溶磷特性測定 利用PKO培養基，先將供試菌株點接種于盛有PKO 固體培養基上，每皿點接4 個重復，每菌株3 皿，28 ℃ 條件下培養10 d。觀察接種菌株周圍有無透明圈形成，以判斷該菌株有無溶磷能力[16]。制備上述能夠形成透明圈菌株的懸浮液(1×108個/mL)。取1 mL菌株懸浮液接種于50 mL液體培養基中(每一菌株6個重復)，置于恒溫搖床(28 ℃,160 r/min) 培養10 d 之后在4 ℃下離心(10000 r/min)15 min，取上清液用鉬酸銨比色法測定有效磷(H2PO4-)含量[16]。以不接種菌株為對照。

1.2.3 優良菌株分泌IAA 性能測定 利用CCM液體培養基。將1 mL菌株懸浮液(1×108個/mL) 接種于盛有50 mL CCM 液體培養基的三角瓶中(每一菌株4個重復)，置于恒溫搖床(28 ℃,125 r/min)培養12 d。

比色液的組成及配方：0.5 mol/L FeC131 mL，濃H2SO430 mL ，蒸餾水50 mL。取上述在CCM液體培養基上生長12 d 的菌株懸浮液1 滴置于白瓷板上，加1滴比色液。對照只在比色液中加1 滴50 μg/mL的生長素(IAA)，不加菌株懸浮液。將白瓷板置室溫下15 min 后觀察其顏色變化，顏色變粉紅者為陽性，否則為陰性，以確定該菌株有無產生生長素的能力。菌株培養液經低溫離心后，取其上清液置于冷凍干燥儀中濃縮，并用1 mol/L HCl 調pH至2.8。用乙酸乙酯提取IAA(菌株培養液∶乙酸乙酯= 1∶3)，提取液在低溫下蒸發至干燥，再用2 mL 100% 乙醇溶解后盛在Eppendorf 小試管中。同時配制50 μg/mL的IAA 標準液。利用高效液相色譜儀( HPLC) 按文獻[16]的方法和步驟測定IAA含量。

1.3 玉米專用菌肥制作及其質量檢測

1.3.1 玉米專用菌肥制作 將上述1.2所得7株優良促生菌株分別接種于LB 液體培養基中，于28 ℃，150 r/min培養48 h。待菌株充分生長后，利用分光光度計測定各菌株懸浮液D660nm值，用無菌水調其D660nm=0.5(即菌株懸浮液109cell/mL)，并將調好的各菌株懸浮液按特定體積比(正在申報專利)混合后備用；稱取已優化載體配方[17](泥炭∶木炭∶花土=2∶2∶1) 350 g，置于滅菌鍋121 ℃，25 min連續滅菌2次。將滅菌后的載體置于無菌操作臺上冷卻后，倒入食品專用袋中；在無菌條件下，將無菌水與載體材料充分混勻，使得載體材料濕潤、松散而不粘結，混合均勻后補加上述備用的混合菌液80～100 mL，繼續混合攪拌均勻，用自動封口機封口。將制作好的菌肥置于28 ℃的培養箱培養7～10 d，備用。并定期對菌肥有效活菌數、是否污染和菌種特性變化等進行檢測。

1.3.2 玉米專用菌肥質量檢測 采用稀釋平板法，將保存在室溫的菌肥分別在30、60、90、120、150、180和210 d各測定1次活菌數；采用肉眼直接觀察法和顯微鏡觀察法，檢查制作的菌肥保存一段時間后是否有霉變(如青霉、曲霉污染)、是否有異味產生、是否出現色變等。

1.4 玉米專用菌肥對葉面積及干物質積累的影響

2013年，以玉米作為研究對象，以試驗區常規施肥量為基準，在此基礎上以此次研究制作的菌肥替代15%，30%和100%化肥用量，測定其替代部分化肥對玉米生長和產量的影響。

1.4.1 試驗區自然概況 試驗地為甘肅省武威市涼州區黃羊鎮農墾農場甘肅農業大學試驗站，地理位置N 37°52′20″,E 102°50′50″。地處甘肅河西走廊東端，屬典型內陸荒漠氣候區， 海拔1 581 m；全年平均無霜期156 d，年降水量164.4 mm，蒸發量1 919 mm，平均氣溫7.8 ℃，日照時數2 968.2 h，≥10 ℃年積溫2 985.4 ℃；年太陽輻射總量504～630 kJ/cm2，麥收后≥10 ℃有效積溫1 350 ℃，屬于典型兩季不足，一季有余農業生產區。供試土壤為灌漠土，試驗地0～10、10～20、20～30 和30 cm 以下土壤容重分別為1.29、1.34、1.41和1.39 g/cm3， 地下水埋深25～30 m。耕層有機質15.71 g/kg、全氮0.87 g/kg、全磷1.02 g/kg、速效磷13.38 mg/kg、速效鉀248.63 mg/kg，pH為8.2。

1.4.2 試驗材料 玉米品種：金穗4號(白銀金穗種業有限公司提供)；

化肥(試驗區市售化肥)：磷二銨(云南三環中化化肥有限公司)，總養分≧64%(N∶P2O5∶K2O=18∶46∶0)；尿素(劉家峽)，總氮含量≧46.4%；

灌溉：采用滴灌;滴灌帶規格:滴頭間距0.30 m，每卷長度為2 200 m，流量為1.4 L/h；地膜寬1.4 m。

菌肥：自制菌肥含量為全氮5.59 g/kg，全磷0.87 g/kg，有效磷43.73 mg/kg，全鉀20.21 g/kg，有效鉀5.61 g/kg。

1.4.3 試驗設計 試驗設5個處理，即A全量化肥，當地高產栽培方式最佳施肥量為純氮450 kg/hm2，磷素(P2O5)225 kg/hm2，當地土壤是富鉀土壤，故不施鉀肥；B 85%化肥+菌肥；C 70%化肥+菌肥；D 菌肥(不施化肥)；E 不施肥；每處理3個重復，共15個小區，采用隨機區組設計，每個小區面積45 m2。行株距為40 cm×30 cm，密度為75 000株/hm2；采用覆膜帶狀種植，玉米4月中旬播種。

1.4.4 專用菌肥及化肥使用方法 播種前先將種子(宜用未包衣玉米種子)用菌肥拌種，置于陰涼、避光處0.5 h (使促生菌充分粘附在種子表面)播種。菌肥用量7.5 kg/hm2。對照與不施肥處理的種子用無菌水拌種。化肥施肥量：對照(全量化肥)用量為尿素890 kg/hm2和磷二銨489 kg/hm2，其余各處理分別按比例減少化肥施用量以菌肥代之。其中，尿素基肥∶追肥(大喇叭口期和開花期)量比為3∶7，分別為基肥∶大喇叭口期追肥∶開花期追肥=3∶4∶3。田間灌水按苗期900 m3/hm2、拔節期1 100 m3/hm2、大喇叭口期1 100 m3/hm2、開花期1 250 m3/hm2、灌漿期750 m3/hm2灌溉。

1.4.5 測定指標 分別在苗期、拔節期、大喇叭口期、開花期、灌漿期、乳熟期、成熟期每次每小區取樣10 株，先稱鮮重，量取葉面積(葉面積=長×寬×0.75)，然后將植株烘干至恒重，再稱干重，供分析測定。分析計算各生育期葉面積，干物質積累量，成熟期經濟產量與干草產量。

1.5 數據處理

數據整理與作圖用Excel 2007，數據分析用Spss 17.0。

2 結果與分析

2.1 優良促生菌株篩選

篩選出7株具有良好促生特性的菌株(表1)，菌株P2-1、P4-4、4N4 具有固氮、溶磷、分泌IAA 特性，其他4 種菌株則不完全具有這3 種特性。這7 種菌株生長速度均較快，且各菌株間的拮抗反應測定，7 株優良菌株間不發生拮抗反應。

表1 優良促生菌株主要特性

注：*表示待鑒定，“-”表示無，“+++”表示生長速度較快

2.2 菌肥質量檢測

將7種優良促生菌株按照特定比例混合，再與優化的載體配方攪拌均勻制成玉米專用復合菌肥，其部分質量檢測結果見表2。

表2 玉米專用菌肥質量檢測

注：“+” 表示污染，“-” 表示無污染。

有效活菌數及雜菌污染是菌肥質量的重要指標。制作的菌肥經恒溫培養7～10 d，貯存于避光、室溫條件下，在質量檢測期間其有效活菌數呈逐漸下降趨勢，但在180 d內有效活菌數均達到65.7×108cfu/g，且無雜菌污染，符合《微生物肥料》NY227-94標準[18]，其中，30 d后的活菌數最多，菌種特性穩定。180 d后，其活菌數迅速下降至9.1×108cfu/g，且伴有雜菌污染和霉變現象。因此，建議菌肥成品后，最好在6個月內使用，確保其肥效的充分發揮。

2.2 菌肥對玉米生長的影響

2.2.1 對玉米葉面積的影響 在玉米各個生育期測定玉米葉面積發展動態，結果表明(圖1)，各處理間玉米葉面積在拔節期前增長比較緩慢，拔節期之后玉米葉片增大增多，葉面積迅速增加，至開花期達到最大值，此后灌漿期、乳熟期、成熟期增長速度減慢，且總葉面積呈現下降趨勢，但配施菌肥處理的葉面積下降量較全量化肥處理幅度較小。其中100% 菌肥(D)處理和不施肥(E)處理總葉面積整體低于其他3 個處理，但D 處理葉面積高于不施肥處理。全量化肥(A)處理、85% 化肥+菌肥處理(B)和70% 化肥+菌肥(C)處理三者之間葉面積發展變化動態表現為處理B>A 和C，A 與C 總葉面積基本相同。總之，各處理對玉米葉面積的發展動態變化影響各異，但整體發展規律基本一致。

圖1 玉米各生育期葉面積變化

2.2.2 對玉米地上干物質積累的影響 對玉米不同生育期干物質積累測定結果表明(圖2)，不同處理的玉米地上干物質積累速率在拔節期之前相同，拔節期后地上干物質增長速率各不相同，但均在開花期到乳熟期干物質積累速率達到最大，乳熟期之后干物質積累速率減緩；在開花期之后表現出85%化肥+菌肥(B)>全量化肥(A)處理>70%化肥+菌肥(C)>100%菌肥(D)>不施肥(E)。拔節期后，玉米干物質的積累速率與積累量都出現了較大變化，但均符合“慢、快、慢”的“S”型生長規律，且干物質最終的積累量表現為B>A>C>D>E。

圖2 玉米各生育期干物質積累量

2.2.3 對玉米產量的影響 不同施肥處理玉米經濟產量表現為B>A>C>D>E，處理B 顯著高于其他施肥處理，處理A與C，D與E 間差異不顯著，處理B 較E (不施肥對照)增產27.9%，比全量化肥處理A 增產2.7%(表3)；不同施肥處理玉米干草產量均表現為處理A、B、C之間差異不顯著，均顯著高于處理D和E，而且表現為處理B>A>C>D>E，處理B 較E 干草產量增加26.4%，比全量化肥處理A 增產2.1%。表明施用菌肥時，減少15%化肥用量不但不會降低玉米經濟產量和干草產量，還略有提高；減少30% 化肥用量對玉米的經濟產量及干草產量均有所下降，但差異不顯著，在農業生產中可根據玉米的不同用途采取不同菌肥配施化肥減量梯度。

3 討論與結論

從玉米根際分離出28株菌株，經固氮、溶磷、分泌IAA 特性測定篩選出7 株優良促生菌株，將其制作成玉米固體生物菌肥，以替代15%～30%化肥，測定其對玉米葉面積與干物質積累的影響，結果表明，菌肥替代15%化肥與全量化肥相比，對玉米葉面積與干物質積累有不同程度的提高；菌肥替代30%化肥與全量化肥相比，對玉米葉面積與干物質積累影響不大，與全量化肥基本一致。因此，在菌肥替代化肥15%～30%可能存在一個最佳物替代量，既可以減少化肥投入，又不對玉米造成影響，這個最佳物替代量還需進一步試驗。

表3 不同施肥處理玉米經濟產量及干草產量

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

玉米菌肥替代部分化肥對玉米地上干物質積累的影響，雖然各處理變化有差異，但干物質積累符合“慢、快、慢”的S 型生長曲線，這與黃智鴻等[19]玉米干物質積累與分配的研究結果一致。苗期到大喇叭口期，由于生長中心以地下為主，同時葉片偏小，光合產生的有機物質主要供給根系生長，地上干物質積累速率較慢。從大喇叭口期到乳熟期，生長中心從地下轉移到地上營養器官，再逐步從莖葉轉到穗子、籽粒上，此時氣溫高，光照強，葉面積大，光合作用較強，地上物質積累呈現較快增長。從乳熟期到成熟期，有效葉面積減小，光合作用減弱，干物質積累均呈現平緩增長。干物質積累量最終表現出85%化肥+菌肥>全量化肥>70%化肥+菌肥>100% 菌肥>不施肥處理，在開花期之后的干物質積累量表現為85%化肥+菌肥處理>全量化肥處理≥70%化肥+菌肥，這與微生物的作用較化肥滯后但長效有關，在植物生長后期的促生效果比較明顯，其作用優于全量化肥處理。

玉米葉片作為玉米有機物質生產的主要器官，其葉面積大小及光合作用的強弱對玉米的生長發育有著重要影響。結果表明，各處理間玉米葉面積在整個生育期的發展動態一致，均表現出各處理間玉米葉面積在拔節期前增長比較緩慢，拔節期之后玉米葉片增大增多，葉面積迅速增加，至開花期達到最大值，此后在灌漿期、乳熟期、成熟期增長速度減慢，總葉面積呈下降的趨勢。這與楊國虎等[20]、黃智鴻等[19]研究結果一致。全量化肥(A)處理、85%化肥+菌肥處理(B)和70%化肥+菌肥(C)處理，三者之間葉面積變化動態表現為處理B>A 和C，A 與C 總葉面積基本一致。而玉米經濟產量與干草產量變化顯著，處理B相比全量化肥增產均在2.1%～3.6% ，這與席琳喬等[21]利用分離自禾本科牧草根際的聯合固氮菌對燕麥株高及產量的顯著促進作用及姚拓等[22]報道的聯合固氮菌對燕麥株高的明顯促進作用研究結果一致。研究分析，不同施肥處理以處理B 對玉米生長的促進效果最佳，處理C 次之，可能由于菌肥配施化肥的原因，菌肥中的PGPR 在玉米根際生長繁殖過程中直接給玉米提供某些營養元素或者溶解土壤中難溶性營養元素供植物吸收，而且產生對植物有益的代謝產物，如CTK、IAA、GA、ABA 等，都不同程度地對玉米生長進行調節，促進其健康生長，營養狀況得到改善，從而提高玉米的經濟產量及干草產量。同小娟等[23]利用EM 微生物堆肥在夏玉米和冬小麥的試驗結果表明，年均總產量比傳統堆肥增產8.3%～8.9%，其中，夏玉米增幅最大為9.4%，而冬小麥增產8.3%。試驗證明微生物肥料在農業生產過程中，對作物促生及減少化肥投入方面發揮著不可替代的作用，綜上所述，玉米專用菌肥在玉米生產中具有很高的應用潛力，同時減少化肥投入也在一定程度上減輕了對生態環境的破壞。

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