TLR4及相關炎性因子在糖尿病腎病中的表達及臨床意義

秦寧寧 王秋月

(中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科，遼寧 沈陽 110001)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病重要的慢性并發癥，最終可以引發腎衰竭。目前DN治療主要是控制血糖和血壓，但并不能阻止腎病的發生和發展。免疫和炎癥反應在DN的過程中起著重要的作用。Toll樣受體4(TLR4)是一種Toll樣受體，識別內毒素-脂多糖(LPS)及熱休克蛋白(HSP)等內源性配體，激活核因子-κB(NF-κB)啟動炎性因子的轉錄和合成，最終釋放大量的炎性因子，參與炎性反應〔1,2〕。本研究擬通過觀察DN患者腎小管的病理變化，分析TLR4的表達改變與炎癥因子表達的關系，旨在探討TLR4及炎癥因子表達的關系在DN中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對象 2011年9月至2013年12月于中國醫科大學腎內科住院經臨床和腎活檢確診為DN的患者27例。其中男12例，女15例，年齡41～64歲。尿蛋白含量均>500 mg/d。并將DN組患者根據尿蛋白定量分為低蛋白尿組(0.5～2g/d)和高蛋白尿組(>2 g/d)。均符合1999年WHO、IDF公布的糖尿病及DN診斷標準。對照組為同期本院泌尿外科腎癌根治術患者10例，其中男6例，女4例，年齡37～62歲。并取腎臟遠離腫瘤組織未被浸潤的病理診斷為正常的腎組織。所有對象均排除高血壓、急性感染、吸煙等干擾因素，無年齡、性別等統計學差異。

1.2試劑 免疫組化試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；兔抗人TLR4多克隆抗體(美國santa cruz公司)；兔抗人單核細胞趨化蛋白(MCP-1)多克隆抗體(美國santa cruz公司)；兔抗人白細胞介素(IL)-18多克隆抗體(美國Abcam公司)。

1.3儀器 全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)；石蠟切片機(德國leica公司)；-20℃冰箱(日本HITACHI公司)；恒溫水浴箱(上海醫療器械七廠)。

1.4檢測指標及方法 于腎活檢前1天收集DN患者血、尿標本，術前收集對照組患者血、尿標本。常規生化方法檢測24 h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)。免疫組化法檢測各組腎組織標本的TLR4、MCP-1、IL-18的表達，常規石蠟制片、切片、脫蠟。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min，3次，過氧化氫孵育10 min，PBS液沖洗，1%Triton-100浸泡10 min，封閉，加入一抗，孵育12 h，PBS液沖洗，加入二抗孵育20 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色10 min，復染，脫水，封片。

1.5半定量表達評估 對腎小管上皮細胞TLR4、MCP-1、IL-18表達著色面積的評分，計數各抗原呈陽性表達的腎小管上皮細胞占上皮細胞總數的百分率，分值設為0～4分，0分無陽性表達；1分弱表達，陽性細胞率<25%；2分中表達，陽性細胞率占25%～50%；3分為高表達，陽性細胞率占51%～70%；4分為強表達，陽性細胞率占70%以上。每張切片隨機選取20個視野(×100倍)，計算20個視野的評分值取平均值，得到各抗原的表達計分。

2 結 果

2.1各組尿蛋白定量、Scr等臨床指標的測定 DN組與對照組比較，年齡性別均無顯著性差異。DN組患者的24 h尿蛋白定量及Scr水平顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 兩組臨床指標比較±s)

2.2腎組織中TLR4、MCP-1、IL-18的表達 對照組腎組織上皮細胞TLR4無表達，MCP-1、IL-18基本無表達。DN組TLR4、MCP-1、IL-18在腎小管上皮細胞胞漿顯棕黃色，明顯為高表達，與對照組比較，DN組患者腎小管上皮細胞TLR4、MCP-1、IL-18的表達顯著升高(P<0.01)。DN組中高蛋白尿組的各項評分明顯高于低蛋白尿組(P<0.05)。見圖1。

圖1 免疫組檢測腎組織中TLR4、MCP-1、IL-18的表達(×400)

2.3腎組織中TLR4的表達與各炎性因子及臨床指標的關系 DN組TLR4的表達水平與MCP-1、IL-18、24 h尿蛋白定量及Scr水平呈顯著正相關(R=0.683 39,0.613 31,0.645,0.571 2，P<0.05)。

3 討 論

DN是糖尿病重要的并發癥之一，其最終都會引發腎衰竭。其發病機制可能是病人在高血糖狀態下機體氧化應激、腎血流動力學因素的改變等因素相互作用的結果〔3〕。現在的臨床治療對DN只有延緩病情的作用，不能阻止其發展至終末期腎衰竭。糖尿病為一種代謝紊亂引起的慢性炎癥疾病，炎性因子是促進糖尿病并發癥的主要因素。DN的病理生理過程都有炎癥的參與，且對病程的進展起著決定性的因素〔4〕。本研究結果提示蛋白尿在DN引起的腎小管間質炎癥中起著重要的作用。TLR4作為一種巨噬細胞受體，是免疫反應上游的重要調節因子，在高糖環境下，激活NF-κB,進而調節MCP-1等炎癥因子的轉錄表達〔5〕。本實驗顯示，DN組TLR4高表達，TLR4信號通路激活，促進了MCP-1炎性因子的釋放，提示DN患者的腎小管上皮細胞中MCP-1的產生于TLR4受體通路有關。在眾多炎性因子中，IL-18對DN的發生和發展起著重要的作用〔6〕，本實驗還表明DN患者體內的高糖信號通過激活TLR4信號通路，使相關受體活化，誘導IL-18等炎性因子釋放，進入促進腎間質炎性的產生及發展。炎癥是推進DN發展的重要因素，而尿蛋白量是判定DN炎癥損傷的最敏感性指標。TLR4的表達與DN的關系尿蛋白及相關炎性因子與TLR4表達的密切相關性，對探索DN發生、發展的病理機制提供新的靶點。

4 參考文獻

1Ohashi K,Burkart V,Flohe S,etal.Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex〔J〕.J Immunol,2000;164(2):558-61.

2Michelsen KS,Doherty TM,Shah PK,etal.TIR signaling: an emerging bridge from innate immunity to atherogenesis〔J〕.J Immunol,2004;173(10):5901-7.

3Schmitz J,Owyang A,Oldham E,etal.IL-33 an interleukin-1 like cytokine that signals via the IL-1 receptor related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines〔J〕.Immunity,2005;23(5): 479-90.

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5Amann B,Tinzmann R,Angelkort B.ACE inhibitors improve diabetic Nephropathy through suppression of renal MCP-1〔J〕.Diabetes Care,2003;26(8): 2421-5.

6Navarro-Gonzalez JE，Mora-Fernandez C.The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Nephro1,2008;19(3):433-42.