芹菜素通過下調MDR-1/P-gp表達逆轉結腸癌耐藥細胞HCT-8/5FU多藥耐藥性的作用及機制

邢海軍 崔海燕 趙建虎

(張家口市宣化區醫院,河北 張家口 075000)

老年結腸癌在其診斷治療方面有其特有的特點，如癥狀隱匿、早期就診少、手術耐受性差、化學治療尤為重要等，但在化療過程中產生多藥耐藥是臨床化療成功的主要障礙，因此研究結腸癌多藥耐藥機制及尋找高效逆轉劑具有重要意義〔1〕。芹菜素是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的黃酮類化合物，研究發現具有廣泛生物活性，例如抗感染、抗腫瘤及抗氧化等〔2～4〕。但芹菜素對于多藥耐藥細胞的逆轉作用研究尚少見，故本課題以結腸癌耐藥細胞株HCT-8/5-FU為研究對象，觀察芹菜素對多藥耐藥人結腸癌細胞(HCT-8/5-FU)P-糖蛋白(P-gp)的抑制作用以及對HCT-8/5-FU細胞多藥耐藥耐藥性的逆轉作用。

1 材料與方法

1.1材料 芹菜素，購于Sigma；CCK-8試劑盒、細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒購于碧云天生物技術研究所；鼠抗人P-gp白單克隆抗體購于中杉金橋；總RNA抽提試劑盒、AMV一步法RT-PCR試劑盒購于上海生工有限公司，MDR-1及內參基因引物由上海生工有限公司合成；敏感細胞株HCT-8及其耐藥細胞株HCT-8/5-FU購自凱基生物科技發展有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 敏感細胞株HCT-8培養于無Hepes,含10%小牛血清、100 U/ml慶大霉素的RPMI-1640培養液中，置37 ℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中傳代培養；相應耐藥細胞株HCT-8/5-FU細胞連續培養于含15 000 ng/ml的上述培養液中，以維持其耐藥性，實驗前3 d換無藥物的培養液培養。

1.2.2免疫細胞化學法測定耐藥細胞P-gp的表達 實驗設0、10 μmol/L芹菜素組，取對數生長期細胞，按每孔2×105個接種于放蓋玻片的6孔板中，貼壁后加入不同實驗濃度藥物，培養24 h后取出蓋玻片，多聚甲醛固定10 min，按常規S-P兩步法染色。根據細胞染色陽性率分級，無陽性為陰性(-)，陽性率低于25%為弱陽性(+)，陽性率在25%～75%之間為中陽性()，陽性率大于75%為強陽性()。

1.2.3RT-PCR檢測耐藥細胞MDR-1 mRNA的表達 HCT-8/5-FU耐藥細胞經0、10 μmol/L 芹菜素組作用24 h后，用總RNA抽提試劑盒抽提總RNA，以β-actin 作為內參照，按照AMV一步法RT-PCR試劑盒說明書檢測耐藥細胞內MMDR-1 mRNA的表達情況，MDR-1上游引物：5'-CTGGTTTGATGTGCACGATGTTGG-3'，下游引物：5'-TGCCAAGACCTCTTCAGCTACTG-3'，擴增產物296 bp；β-actin上游引物：5'-GACTATGACTTAGTTGCGTTA-3'，下游引物：5'-GTTGAACTCTCTACATACTTCCG-3'，擴增產物501 bp 。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析結果。

1.2.4CCK-8法測定無細胞毒作用的芹菜素 取處于對數生長期的HCT-8、HCT-8/5-FU兩株細胞經胰酶消化后計數 ,調整細胞懸液密度為1×105/ml，接種于96孔培養板,每孔100 μl，37 ℃、5%CO2培養箱中孵育 24 h后，加入不同濃度的芹菜素溶液(5,10,20,40，80 μmol/L)，同時設空白對照組(不加細胞僅加培養液)、陰性對照組(不加藥物僅加細胞)。每組均設 4個復孔，置于培養箱中再孵育 24 h后每孔加入20 μl CCK-8溶液,繼續孵育4 h，以全自動熒光酶儀檢測各孔在490 nm處的光吸收值(A)，由空白孔調零后，計算芹菜素對兩株細胞的生長抑制率。

1.2.5芹菜素對耐藥細胞耐藥性逆轉作用的檢測 實驗分為HCT-8/5-FU+5-FU組，HCT-8+5-FU組，HCT-8/5-FU+5-FU+無細胞毒作用的芹菜素組，5-FU終濃度分別為15， 60,240,960，3 840 μg/ml，實驗步驟同上，分別計算出各組的IC50值，進而計算出耐藥倍數及逆轉倍數。

1.2.6熒光顯微鏡觀察細胞凋亡 將耐藥細胞株HCT-8/5-FU分為逆轉藥物組(無細胞毒作用的芹菜素組)、化療藥物組(無細胞毒作用的5-FU組)、聯合用藥組、陰性對照組(未加任何藥物)。取潔凈的蓋玻片置于6孔板內，種入處于對數生長期的細胞懸液，分別加入上述分組處理因素，培養24 h后，固定、染色，選擇激發波長350 nm，發射波長460 nm，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞情況。正常細胞核出現彌漫均勻的低強度熒光，凋亡細胞核呈濃染致密的固縮形態,顏色有些發白。細胞凋亡指數計算：每組觀察3張片子，每張片子隨機選擇3個視野，計數100個細胞中凋亡百分率。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行獨立樣本t檢驗及χ2檢驗。

2 結 果

2.1芹菜素抑制P-gp表達 HCT-8/5-FU細胞 P-gp呈強陽性(98.97+2.19)%；經10 μmol/L芹菜素作用24 h后,HCT-8/5-FU細胞 P-gp呈中陽性(59.87+3.25)%； 二者差異顯著(P<0.05)。見圖1。

2.2芹菜素下調MDR-1 mRNA表達 耐藥細胞HCT-8/5-FU高表達MDR-1 mRNA ,經10 μmol/L芹菜素處理后，其MDR1 mRNA 表達水平降低。見圖2。

未加芹菜素組 10 μmol/L芹菜素組

1，2：β-actin；3:Marker(100～1 000 bp)； 4:未加芹菜素組；5:10 μmol/L芹菜素組

2.3芹菜素具有細胞毒作用 表1可見，芹菜素對HCT-8/5-FU、HCT-8兩細胞株生長抑制作用相近，其在10 μmol/L以下時對兩組細胞株均無明顯的細胞毒作用，抑制率均在10%以下，芹菜素對兩種細胞的IC50值分別為(79.71±8.65)、(81.70±5.24) μmol/L，二者比較差別無統計學意義(P>0.05)。

表1 不同濃度芹菜素作用HCT-8/5-FU、HCT-8細胞24 h抑制作用±s,%,n=4)

2.4芹菜素具有逆轉耐藥作用 5-FU對HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的IC50值分別為(830.23±21.79)、(80 242±112.58)、(5 086.1±98.87)μg/ml，耐藥細胞株對5-FU的耐藥倍數為96.68倍，10 μmol/L芹菜素對耐藥細胞的逆轉倍數為15.78倍。見表2。

2.5聯合用藥更能誘導細胞凋亡 HCT-8/5-FU細胞株經10 μmol/L芹菜素，509 μg/ml 5-FU作用24 h后均未見明顯凋亡細胞，凋亡指數分別為(9.88±0.58)%、(8.99±0.69)%，二者比較無統計學意義(P>0.05)。經10 μmol/L芹菜素+509 μg/ml 5-FU聯合用藥后可見明顯凋亡，凋亡指數達(40.21±0.95)%，與前兩者凋亡指數之和比較具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

陰性對照組

5-FU組

芹菜素組

芹菜素+5-FU組

表2 5-FU作用24 h對HCT-8、HCT-8/5-FU、HCT-8/5-FU+芹菜素的抑制作用±s,%，n=4)

3 討 論

P-gp是最重要的藥物外排蛋白，由MDR-1基因編碼而成，能與多種被動擴散到細胞內的藥物結合，依靠ATP轉化能量將到達細胞內的藥物泵出，導致細胞內的藥物濃度降低〔1,5〕。HCT-8/5-FU是一種人結腸癌多藥耐藥細胞株，是通過對敏感細胞株HCT-8用5-FU長期反復誘導而成，高表達P-gp和MDR-1 mRNA〔6〕。本實驗結果提示，芹菜素在轉錄和翻譯水平抑制了P-gp。此藥物可能對多藥耐藥細胞HCT-8/5-FU多藥耐藥性具有逆轉作用 ,進一步，結果證實，10 μmol/L芹菜素能夠提高5-FU細胞毒作用，可使5-FU對HCT-8/5-FU細胞的IC50值從(80 242±112.58)μg/ml降至(5 086.1±98.87)μg/ml，其逆轉倍數可高達15.78倍，并且在選擇芹菜素逆轉耐藥濃度(無細胞毒作用的芹菜素濃度，以排除芹菜素本身對耐藥細胞的殺傷作用)時發現，芹菜素對耐藥及敏感細胞株的IC50無明顯差別，這說明與敏感細胞株相比，耐藥細胞株對芹菜素沒有產生交叉耐藥，芹菜素對逆轉結腸癌多藥耐藥有著廣泛的應用前景。

近年來還有研究發現，P-gp除了作為藥物泵可將到達細胞內的藥物泵出，導致細胞內的藥物濃度降低外，還可通過改變細胞生存的環境，抑制凋亡相關因子活性，減少質膜上的鞘磷脂等機制抑制腫瘤凋亡，從而使腫瘤細胞產生凋亡抗性〔7,8〕。本文結果提示，當5-FU與芹菜素誘導細胞凋亡情況相似時(凋亡指數均小于10%)，聯合用藥后可見明顯凋亡，凋亡指數增至(40.21±0.95)%，與前兩者凋亡指數之和比較具有統計學意義，這說明了芹菜素能夠解除了P-gp產生的凋亡抗性，能夠誘導更多的耐藥細胞凋亡。

綜上所述，體外實驗證實,芹菜素可在轉錄和翻譯水平抑制P-gp，逆轉 HCT-8/5-FU細胞的多藥耐藥性,解除了P-gp產生的凋亡抗性，誘導更多的耐藥細胞凋亡。但關于芹菜素逆轉腫瘤多藥耐藥的體內實驗及其藥物代謝動力學、藥物分析化學的研究還有待進一步完成。

4 參考文獻

1Lee CA,Cook JA,Reyner EL,etal.P-glycoprotein related drug interactions clinical importance and a consideration of disease states〔J〕. Expert Opin Drug Metab Toxicol,2010；6(5):603-19.

2Choi EJ,Kim GH.Apigenin causes G(2)/M arrest associated with the modulation of p21(Cip1) and Cdc2 and activates p53-dependent apoptosis pathway in human breast cancer SK-BR-3 cells〔J〕.J Nutr Biochem,2009;20(4)：285-90.

3Seo HS,Ju JH,Jang K,etal.Induction of apoptotic cell death by phytoestrogens by up-regulating the levels of phospho-p53 and p21 in normal and malignant estrogen receptor α-negative breast cells〔J〕.Nutr Res,2011;31(2):139-46.

4Zheng PW,Chiang LC,Lin CC.Apigenin induced apoptosis through p53-dependent pathway in human cervical carcinoma cells〔J〕.Life Sci,2005;76(12):1367-79.

5Padowski JM,Pollack GM.Pharmacokinetic and pharmacodynamic implications of P-glycoprotein modulation〔J〕.Methods Mol Biol,2010;596(3):359-84.

7Han Y,Bu LM,Ji X,etal.Modulation of multidrug resistance by andrographolid in a HCT-8/5-FU multidrug-resistant colorectal cancer cell line〔J〕.Chin J Dig Dis,2005;6(2):82-6.

8Li YC,Fung KP,Kwok TT,etal.Mitochondria-targeting drug oligomycin blocked P-glycoprotein activity and triggered apoptosis in doxorubicin-resistant HepG2 cells〔J〕.Chemotherapy,2004;50(2):55-62.

9Belhoussine R,Morjani H,Sharonov S,etal.Characterization of intracellular pH gradients in human multidrug-resistant tumor cells by means of scanning microspectrofluorometry and dual-emission -ratio probes〔J〕.Int J Cancer,1999;81(1):81-9.