Smad4在乳腺癌及癌周組織中的表達及意義

姜 晶 王彩芹 劉楠楠

(北華大學附屬醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011)

乳腺癌的發(fā)生是因為原癌基因的激活和抑癌基因的功能失活，其發(fā)展是一個多因素多階段的過程，往往涉及多個基因的改變〔1，2〕，近年來隨著對轉化生長因子(TGF)-β下游重要的信號分子Smad4蛋白研究的不斷深入，其表達的減少或缺失與腫瘤進展的關系逐漸引起人們的重視；Smad4被看作多種腫瘤的抑癌基因。本研究探討Smad4在乳腺癌發(fā)病機制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1資料 我院病理科乳腺腫瘤患者乳腺組織切除標本。乳腺癌70例(高分化型28例、低分化型42例)，伴有相應的癌周組織61例，乳腺纖維腺瘤52例。均為女性，原發(fā)單側，年齡28～78〔平均(47.71±10.13)〕歲。病例臨床資料記錄詳細，且術前均未做過化療及放射治療。

1.2試劑 兔抗人Smad4單克隆抗體，購自英國Abcam公司。通用SP-9000免疫組織化學試劑盒和DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。實驗程序嚴格按照SP法試劑盒說明書操作。

1.3病理診斷標準 乳腺癌及癌周組織中乳腺增生性病變的病理診斷標準參照乳腺增生癥及乳腺癌組織分類標準〔3〕,同時參考WHO乳腺病理學分類(WHO分類)形態(tài)學標準〔4〕。

1.4免疫組織化學染色方法 所有乳腺組織經10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水、透明、浸蠟及包埋，連續(xù)切片，厚4 μm,HE染色，常規(guī)確診，并留取白片待免疫組織化學染色。將切片脫蠟水洗后，pH6.0枸櫞酸鹽修復液高壓修復10 min(噴氣后2 min)，羊血清封閉15 min，加一抗(1∶100稀釋)4℃冰箱內過夜，次日依次滴加二抗，三抗，均在37℃溫箱內孵育20 min，最后DAB顯色，蘇木素染核，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，上述各步驟間均用PBS洗滌切片3次，每次5 min，用已知陽性片做對照，以PBS為一抗做陰性對照。

1.5結果判定 Smad4蛋白陽性染色呈棕黃色或黃色顆粒，陽性細胞結構清晰，陽性染色定位準確(其著色明顯高于背景)，每例切片在高倍視野下，選取5個視野區(qū)，每個視野區(qū)計數(shù)200個細胞。表達強度根據(jù)陽性細胞所占百分比進行評估，并取其平均值。染色結果判定評分；陰性細胞數(shù)<10%為陰性(-)；10%～50%為弱陽性(+)；51%～75%為中度陽性()；>75%為強陽性()。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1乳腺癌組織Smad4陽性率與癌周乳腺增生及纖維腺瘤比較 乳腺癌組織Smad4陽性率分別與癌旁乳腺增生、乳腺纖維腺瘤比較均存在顯著差異(P=0.002，P=0.034)。見表1。

表1 各組Smad4蛋白表達狀況

2.2Smad4在相關乳腺組織中的表達差異 乳腺癌高分化型Smad4陽性表達17例(60.7%)；低分化型陽性表達24例(57.1%)，兩者比較無差異性(P=0.766)。

2.3Smad4在相關乳腺組織中的表達定位 Smad4蛋白呈棕黃色或黃色顆粒，主要呈灶狀或彌漫性表達于細胞質及細胞核，部分間質細胞亦有陽性表達。癌組織，癌周組織及纖維腺瘤均有Smad4表達，但良性病變組織明顯高于癌組織的表達。見圖1。

圖1 各組Smad4表達(×400)

3 討 論

Smad4蛋白是TGF-β超家族下游一類非常重要的細胞內信號轉導分子，是把TGF-β與其受體相結合后產生的信號從胞質傳導到細胞核內的中介分子〔5〕。Smad4由2個保守的球狀功能域及中間的可變的連接區(qū)構成〔6〕。其氨基端區(qū)常被稱為MH1區(qū)，羧基端區(qū)被稱為MH2區(qū)，僅R-Smad和Smad4含有MH1區(qū)。在Smads家族中，只有Smad4為公共介體，Smads所有生物效應都是Smad4與任一種Smad蛋白相互作用的結果〔7，8〕。TGF-β信號轉導的受體和胞內信號轉導分子Smad4等組成一個腫瘤抑制通路，在此過程中Smad4起著瓶頸作用。在通常狀態(tài)下，Smad4分布在整個細胞中，并呈動態(tài)狀態(tài)穿梭于細胞核和細胞質之間，當受體激活引起R-Smad磷酸化后，可使R-Smad與Smad4結合，促進R-Smad得以進入細胞核，最終結合DNA從而作為轉錄因子并發(fā)揮作用。

最近越來越多的研究證實，Smad4與乳腺癌有密切關系〔9～11〕。Smad4蛋白表達的降低可影響TGF-β/Smad4通路中信號的正常傳遞，最終導致上皮細胞的過度增生和分化異常，進而參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

作為TGF-β信號通路最常見的轉導子，Smad4對乳腺癌的發(fā)生發(fā)展同樣起抑制作用〔12，13〕。TGF-β1是多功能肽類生長因子，通過調節(jié)細胞的增殖、分化、移行和凋亡，在抑制腫瘤細胞的增殖中發(fā)揮重要作用。TGF-β可抑制細胞的增殖，Smad4表達量的降低使TGF-β對乳腺癌細胞的增殖抑制功能減弱，而TGF-β得以由抑癌基因向促癌基因轉化〔14〕。Smad4在TGF-β信號轉導通路中發(fā)生基因突變時，阻斷TGF-β1信號向細胞內傳遞，導致細胞對TGF-β作用無反應性，限制TGF-β1的腫瘤抑制作用，使乳腺導管上皮細胞發(fā)生癌變，因此Smad4蛋白是TGF-β信號轉導通路中重要的下游中介分子〔15〕。本研究結果亦提示不典型增生與乳腺癌發(fā)生密切相關〔16〕。

普通性導管增生(UDH)包括一般性輕度增生,囊性增生，腺病性增生，上皮呈扁平狀，亦可呈柱狀或立方狀；不典型導管增生(ADH)尤其易見于增生性纖維囊性變，既有囊腫形成又有間質增生，通常伴有末梢導管和腺泡上皮的增生，上皮增生呈多房，乳頭狀。若導管上皮增生呈現(xiàn)一定的導管原位癌，而新分類稱其為導管上皮內瘤變(DIN),但基于學術上理解及交流方便，診斷時乳腺病變仍保留傳統(tǒng)命名。

乳腺纖維腺瘤由增生的纖維間質和腺體組成，腺體呈卵圓形，圓形或裂隙狀，腺體導管由柱狀或圓柱形上皮細胞構成，伴有圓形一致的核，間質疏松，富含黏多糖。乳腺癌均為浸潤性導管癌(IDN),癌細胞突破導管基膜向間質浸潤，癌細胞排成巢狀，條索狀或伴有大量腺樣結構，癌細胞大小形態(tài)各異，多形性較明顯，核分裂像多見。腫瘤間質有致密的纖維組織增生，癌細胞在間質內呈浸潤性生長。根據(jù)腺樣結構多少確定為高分化型及低分化型。

乳腺增生性病變是病理形態(tài)多樣的復雜病變，重要的是應注意有無不典型增生等癌前病變〔14〕。本結果提示Smad4參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和生物學行為，表明Smad4可能具有類似乳腺癌抑癌基因的作用。Smad4基因在乳腺導管上皮增生、病變的啟動、促進、發(fā)展與浸潤等階段起著重要作用。乳腺增生是乳腺腫瘤的病理基礎。

乳腺癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，由多種遺傳和變異產生，是多種異常的癌基因、抑癌基因共同作用的積累〔17〕。雖然新版(2003年)WHO乳腺良性腫瘤組織分類沒有提到乳腺增生性病變這一概念性名稱，但其內容涵蓋了乳腺增生性病變：上皮性腫瘤中的導管內增生性病變，導管內乳頭狀腫瘤，良性上皮增生以及纖維上皮性腫瘤中的纖維腺瘤。

綜上，Smad4基因的失活在乳腺增生、惡變過程中具有重要意義，即在乳腺增生性病變中Smad4失活則意味著惡變的始動。因此，應用免疫組織化學染色方法檢測乳腺病變組織中的Smad4的表達，對深入了解乳腺癌等惡性腫瘤的生物學行為以及為臨床評估乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，預后判斷都具有重要價值。

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