開口箭不同提取部位對異丙腎上腺素致小鼠心肌肥厚的保護作用

賀海波 白彩虹 鄒 坤 袁 琴 龔學謙 陳置豐 顏為紅 次旦多吉

(三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443002)

開口箭為百合科植物開口箭Tupistra chinensis Bak.的干燥根莖。別名開喉箭、萬年青、巖七、竹根七、虎尾七、馬尾七等，主產于湖北三峽庫區及神龍架林區。該藥使用方便，療效顯著，已有數百年的應用歷史，在土家民間享有極高聲譽，亦為神農架四大名藥之一〔1，2〕。其性寒，味甘、微苦，具有清熱解毒、益氣活血、散瘀止痛之功。主要用于咽喉腫痛，白喉，風濕痹痛，跌打損傷，胃痛，癰腫瘡毒，毒蛇、狂犬咬傷，月經不調等癥的治療〔3〕。現代藥化和藥理學研究發現其主要成分為皂苷類(如呋甾、螺甾)，多是呋甾，其次是螺甾，具有很強的生理和藥理活性〔4～6〕。此外還含有多糖、黃酮、揮發油及微量元素等成分，對中樞神經系統、消化系統、免疫系統和腫瘤防治及抗炎均具有較好的作用〔7～12〕。近年來，隨著樂開禮等〔13～15〕證實其強心作用的存在和筆者在研究中大量強心苷類成分的發現〔5，6〕，其對心血管系統影響日益引起了筆者的關注。在前期研究中，筆者發現開口箭不同提取部位對異丙腎上腺素致小鼠心肌缺血損傷具有較好的保護作用，本研究擬在此基礎上進一步探討其不同提取部位對ISO致小鼠心肌肥厚的保護作用，為其將來臨床應用于心血疾病防治提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物 KM小鼠(清潔級)105只，20～25 g，雌雄各半，由三峽大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2011-0012。動物按性別分籠，飼養于空調室內，室溫(22±2)℃，濕度(60±5)%，喂標準顆粒飼料，自由飲水和攝食，給藥前適應性飼養1 w。

1.2藥物與試劑 開口箭采集于神農架林區木魚鎮，經三峽大學天然產物研究與利用湖北省重點實驗室汪鋆植教授鑒定為百合科鈴蘭族開口箭屬植物開口箭。鹽酸異丙腎上腺素(Isoprenaline，ISO)注射液，上海禾豐制藥有限公司生產，批號110201。卡托普利，中美上海施貴寶制藥有限公司生產，批號0810031；用0.5 %羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制開口箭不同提取部位和卡托普利的灌胃溶液。羥脯氨酸(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、試劑盒購于南京建成生物工程研究所。其他試劑均為市售分析純。

1.3儀器 JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠；JY10001電子稱重器，上海精密科學儀器有限公司；PK-600S 型水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-D(A)型循環水真空泵，上海精科實業有限公司；RE-52-AA 旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；KDM 型調溫加熱套，上海亞榮生化儀器廠；Labconco低溫冷凍干燥儀，美國Labconco公司；UV-2000型紫外-可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司；自動平衡離心機(LDZ5-2型)，北京醫用離心機廠；ULTRACUT-R型超薄切片機，德國Leica公司；Q500型圖像分析儀，德國Leica公司；H-7500型透射式電子顯微鏡，德國Leica公司。

1.4方法

1.4.1開口箭不同提取部位的制備 取開口箭1.0 kg粉碎，加70%乙醇10倍量回流提取3次，每次1 h，合并提取液。提取液抽濾除雜，回收乙醇至無醇味后加水混懸，水液分別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，石油醚萃取部位真空干燥后，得石油醚部位20.0 g；提取液然后用乙酸乙酯萃取至無色，合并乙酸乙酯層，揮干，得乙酸乙酯部位20.0 g；水層繼續用水飽和正丁醇萃取至無色，合并正丁醇層，揮干，得正丁醇部位300.0 g；剩余也揮干，得水溶性部位50.0 g，4℃保存備用，用前以0.5% CMC-Na配制。

1.4.2實驗分組及心肌肥厚模型的制作 將KM小鼠按完全隨機設計分組法分為正常組、模型組、開口箭石油醚部位組、開口箭乙酸乙酯部位組、開口箭正丁醇部位組、開口箭水提部位組和陽性藥卡托普利組，每組15只。開口箭不同提取部位組分別灌胃給予15.6、15.6、234.0和39.0 mg/kg的開口箭提取部位(此劑量依照《湖北省中藥材質量標準》中開口箭成人的臨床用藥量2倍換算成小鼠藥量，然后結合開口箭不同提取部位中的得率來確定)，陽性對照組給予卡托普利30.0 mg/kg(按成人的臨床用藥量2倍換算成小鼠藥量)。按Maulik等〔16〕的方法制作心肌肥厚模型。具體方法簡述如下：模型組、開口箭不同提取部位組和卡托普利組小鼠背部皮下注射ISO 3 mg/kg，每天1次，連續14 d;正常組皮下注射相應體積的生理鹽水。每日上午注射ISO 4 h后，分別灌胃給予相應的藥物，每日1次，連續14 d;模型組和正常組均灌胃給予等體積的0.5%CMC-Na。記錄給藥期間小鼠一般狀況，所有小鼠于給藥14 d后進行相關指標的檢測。

1.4.3心臟重量指數測定 于末次給藥的次日，放血處死小鼠，迅速開胸取出小鼠心臟，于預冷的生理鹽水(4℃)中洗凈余血，濾紙吸干，沿房室溝剪掉心耳、心室周圍結締組織，于電子天平上稱取全心重量；然后緊貼室間隔右側剪下右心室游離壁，剩余部分(包括室間隔)為左心室重量，分別計算全心重指數和左心室重量指數。

1.4.4心肌組織Hyp含量、氧化損傷和NOS系統相關指標測定 取左心室心肌組織，用冰生理鹽水沖洗去血液，濾紙吸干，稱質量后，加9倍生理鹽水，在冰水浴中用玻璃研磨器研制成10%的勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液至于-20℃冰箱保存備用。心肌組織中Hyp、MDA和NO含量及SOD、GSH-Px、iNOS和cNOS活性的測定按試劑盒說明書方法進行。

1.4.5病理學指標觀察 取左心室中段橫截面心肌組織，用4%多聚甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，常規石蠟包埋，石蠟切片，然后分別進行HE和苦味酸-天狼星紅染色。在HE染色切片中，測量400倍光鏡下每個心肌細胞跨核的最窄直徑和心肌細胞橫截面積；在苦味酸-天狼星紅染色中，心肌細胞呈黃色，膠原呈紅色。用計算機圖像分析，通過灰度調節區別膠原和非膠原成分，測量左心室的膠原容積分數(心肌膠原面積/所測視野面積)。每張切片各隨機分析6個視野，并取平均值。

1.4.6心肌超微結構觀察 每組隨機選取3只動物的心臟的部分左心室心肌組織，迅速投入40.0 ml/L戊二醛與0.009 mol/L草酸鉀混合固定液中4℃固定1.5 h，再用0.009 mol/L KH2PO4溶液洗滌15 min，然后切成薄片。此薄片用10.0 g/L四氧化鋨和20.0 g/L焦銻酸鉀混合液室溫下固定2.0 h，再用pH 10.0蒸餾水洗滌15 min，再用乙醇系列脫水，環氧樹脂包埋，行超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鋁雙重染色后，透射電子顯微鏡觀察。

2 結 果

2.1小鼠一般狀況 正常組小鼠精神狀態佳，反應敏捷，活動度好；造模后小鼠活動度減少，易激惹；開口箭不同提取部位組及陽性藥卡托普利組則有所改善。

2.2開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心臟重量指數的影響 模型組小鼠全心和左心室重量指數明顯增加，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，在改善全心重量指數方面，乙酸乙酯部位和正丁醇部位與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)，在改善左心室重量指數方面，水部位和乙酸乙酯部位、正丁醇部位與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)；陽性藥卡托普利在改善全心和左心室重量指數方面與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.01)。實驗結果表明，開口箭不同提取部位均可改善ISO致心肌肥厚小鼠心臟重量指數，其中以正丁醇和乙酸乙酯部位作用效果更為顯著，特別是正丁醇部位組，其作用效果與卡托普利組基本相仿。見表1。

2.3開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌組織中Hyp含量的影響 模型組小鼠心肌組織中Hyp含量明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，其各部位能明顯降低心肌組織中Hyp含量，與模型組比較，除石油醚部位組外，均具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。見表2。

表1 開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心臟重量指數的影響

表2 開口箭不同提取部位對心肌肥厚小鼠心肌組織中Hyp和氧化損傷指標的影響

2.4開口箭不同提取部位對心肌肥厚小鼠心肌組織中氧化損傷指標的影響 模型小鼠心肌組織中MDA含量明顯升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，其石油醚部位對上述指標有一定的改善作用，其中對SOD活性的影響與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)；乙酸乙酯和正丁醇部位均可顯著改善上述指標，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)，其中以正丁醇部位作用效果更為顯著；水部位對上述指標也有一定的改善作用，其中對SOD和MDA活性的影響與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)；陽性藥卡托普利在改善心肌氧化損傷指標方面與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

2.5開口箭不同提取部位對心肌肥厚小鼠心肌組織中NOS系統含量的影響 模型組小鼠心肌組織中iNOS、NO水平明顯升高，cNOS活性顯著降低，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，其石油醚部位和水部位對上述指標均有不同程度的改善作用，其中對cNOS活性和NO含量的影響與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05)；乙酸乙酯和正丁醇部位均可顯著改善上述指標，與模型組比較具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)，其中以正丁醇部位作用效果更為顯著；陽性藥卡托普利在改善上述指標方面與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。見表3。

表3 開口箭不同提取部位對心肌肥厚小鼠心肌組織中NOS系統含量的影響

2.6開口箭不同提取部位對心肌肥厚模型小鼠心肌細胞直徑和橫截面積的影響 正常組心肌細胞形態正常，心肌纖維排列整齊、結構清楚，無心肌纖維的破壞和炎性滲出，細胞胞核清晰、胞間間隙正常；模型組心肌組織可見心肌纖維束寬大和大量纖維化，心肌細胞直徑和橫截面積明顯增加，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，心肌細胞肥厚程度，纖維化程度及心肌細胞直徑和橫截面積均有不同程度的改善；在降低心肌細胞直徑方面，乙酸乙酯和正丁醇部位組與模型比較具有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)；降低心肌細胞橫截面積方面，開口箭四個不同提取部位與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。見表4和圖1。

表4 開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌細胞直徑、橫截面積和心肌間質膠原容積分數的影響

2.7開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌間質膠原容積分數的影響 心肌組織經苦味酸-天狼星紅染色后，光鏡下觀察，可見心肌細胞呈黃色，膠原纖維呈紅色。心肌間質膠原含量經半定量分析顯示，模型組心肌間質膠原容積分數明顯升高，與正常組比較具有顯著性差異(P<0.01)；用開口箭不同提取部位治療后，心肌間質膠原容積分數均有不同程度的降低，開口箭四個不同提取部位與模型組比較均有顯著性差異(P<0.05和P<0.01)。見表4和圖2。

2.8開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌超微結構的影響 電鏡下觀察，可見正常組小鼠心肌肌原纖維排列整齊，肌節長度一致、排列規整，肌絲清晰；細胞核發育良好，核周圍有大量線粒體；線粒體形狀規則，結構清晰，內嵴排列緊密，無腫脹及空泡樣變、水樣變等。模型組心肌肌原纖維排列紊亂、模糊且有大量空泡，肌節縮短，排列不規整，肌絲溶解、消失，肌漿網擴張；可見細胞核異形變，異染色質邊集，亦可見核內空泡樣變及核膜模糊，核周細胞器呈點狀、碎片狀等變化；多數線粒體明顯腫脹，線粒體內嵴松散分開，線粒體間糖原散在，閏盤排列紊亂，有斷裂現象，心肌細胞內出現大量溶酶體。用開口箭不同提取部位治療后，上述心肌細胞和心肌肌原纖維的異常改變得到了不同程度的改善，其作用效果以乙酸乙酯部位和正丁醇部位更為顯著；在電鏡下可見上述兩個治療組心肌病變的程度明顯減輕，心肌肌原纖維排列較規整，肌節排列亦較為整齊，肌絲溶解較模型組明顯減少，細胞核完整，線粒體腫脹明顯減輕，線粒體內嵴的排列整齊。實驗結果提示開口箭對ISO致小鼠心肌肥厚有較好的保護作用。見圖3。

A：正常組，B：模型組，C：石油醚部位組，D：乙酸乙酯部位組，E：正丁醇部位組，F：水部位組，G：卡托普利組；下圖同

圖2 開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌間質膠原容積分數的影響(苦味酸-天狼星紅，×200)

圖3 開口箭不同提取部位對ISO致心肌肥厚小鼠心肌超微結構的影響(×60 000)

3 討 論

心肌肥厚是心臟對冠心病、高血壓等心血管疾病的一種病理狀態的代償反應，其表現為心肌細胞體積增大、細胞收縮蛋白成分改變和心肌間質細胞增生。初期心肌肥厚對機體是一種有益的適應性反應，其目的是平衡心肌應激能力的增加，減輕室壁壓，實現短期維持心輸出量，但長期應激所致的持續性心肌肥厚最終可導致擴張型心肌病、心力衰竭和猝死〔17～19〕，因此防治心肌肥厚有重要意義。盡管西醫臨床上可供選擇的藥物(如血管緊張素轉化酶抑制藥、血管緊張素受體阻斷藥、鈣拮抗劑等)很多，因其對肝、腎、脾、胃等器官傷害較大，成為較為棘手問題。因此，國內外醫藥專家和患者都在努力尋找有效無毒的天然制品，使得當前中醫藥在心肌肥厚防治領域的日益受到國內外學者的關注。

開口箭作為土家族廣為應用的民間草藥，對中樞神經系統、消化系統、免疫系統和腫瘤防治及抗炎等均有較好作用〔7～12〕。近年來，隨著筆者在其化學成分研究中大量強心苷類成分的發現，激發了筆者對其在心血管作用方面的關注，結合樂開禮等人〔13～15〕對其強心活性的報道和筆者前期實驗結果，筆者設計了小鼠小劑量連續皮下注射ISO誘導心肌肥厚的實驗。由于ISO為β受體激動劑，它一方面可加快心率、加速傳導，心肌耗氧量明顯增加，環磷酸腺苷生成和糖原合成增加，從而促進心肌細胞總蛋白和非收縮蛋白合成，使心肌收縮力增強，心率加快，導致心肌細胞肥大、膠原纖維增生，產生心肌肥厚；另一方面，由于循環和心臟局部兒茶酚胺含量增加，可引起脂質代謝異常及引起體內氧自由基(oxygen free radical，OFR)生成增加，使心肌受損和能量缺乏，進而導致心肌肥厚的發生發展，其具體表現為心肌細胞體積增大和細胞外基質膠原纖維大量沉積〔20〕。本實驗結果顯示，模型組小鼠心臟重量指數明顯增加，心肌組織可見心肌纖維束寬大和大量纖維化，心肌細胞直徑和橫截面積明顯增加，心肌間質膠原容積分數明顯升高。實驗結果也與文獻報道一致〔21〕，提示心肌肥厚模型制作成功。用開口箭石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位治療后，心臟重量指數、心肌細胞直徑和橫截面積、心肌間質膠原容積分數、心肌細胞肥厚程度明顯降低，纖維化程度顯著減輕，顯示出了對心肌肥厚較好的保護作用。

綜上所述，開口箭的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位均能升高ISO致小鼠心肌肥厚的心肌組織中SOD、GSH-Px和cNOS活性，減少Hyp、MDA、NO含量和iNOS活性，降低心肌細胞直徑和橫截面積，心肌間質膠原容積分數，使心肌細胞肥厚程度明顯降低，纖維化程度明顯減輕；在開口箭的四個提取部位中，其作用效果以正丁醇部位最為顯著，其余依次為乙酸乙酯部位、水部位和石油醚部位。實驗結果表明，清除OFR、抗脂質過氧化及逆轉NOS系統異常的表達水平，提高機體的抗氧化能力可能是開口箭抗心肌肥厚的作用機制之一。

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