獨(dú)活香豆素對(duì)帕金森病模型大鼠抗氧化功能及谷氨酸含量的影響

裴 媛 馬賢德 易 杰 李 姍 王思懿 馬 進(jìn)

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110000)

帕金森病(PD)是中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，目前西醫(yī)以左旋多巴為最有效的治療藥物，但其僅能改善癥狀，且長期應(yīng)用有嚴(yán)重的副作用。中醫(yī)治療以平肝補(bǔ)腎、益氣活血中藥居多〔1〕。本文擬觀察獨(dú)活香豆素對(duì)蛋白酶體抑制劑Lactacystin誘導(dǎo)的PD模型大鼠抗氧化功能及興奮性氨基酸谷氨酸(Glu)含量的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD成年大鼠72只，購于中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(遼)2008-0005，雌35只，雄37只，體重：280～300 g。飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，自然光線，自由飲食。正常飼養(yǎng)1 w后，進(jìn)行模型制備。飼料為遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.1.2試劑及藥品 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Glu試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)：201109；Lactacystin由美國sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)：L6785；獨(dú)活香豆素：中藥飲片獨(dú)活一次性購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥局，后經(jīng)沈陽藥科大學(xué)采用超臨界CO2萃取方法提取獨(dú)活香豆素；美多巴：上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)SH1186；布洛芬：中美史克制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 11030064。

1.1.3主要儀器設(shè)備 紫外分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；離心機(jī)：C4-12型，法國JOUAN捷安集團(tuán)(公司)生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1PD大鼠模型制備 72只大鼠按性別、體重隨機(jī)取11只(6雄，5雌)分為正常對(duì)照組，其余61只為PD模型復(fù)制組。參照文獻(xiàn)〔2〕，采用Lactacystin腦定位注射法制備模型。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，大鼠固定在立體定向儀上，齒桿較耳桿低2.4 mm，根據(jù)《大鼠腦立體定向圖譜》〔3〕，確定造模給藥部位為左側(cè)黑質(zhì)致密部，即前囟后5.2 mm、矢狀縫左側(cè)2.2 mm、硬膜下7.2 mm。切開顱部皮膚，鉆開顱骨(勿傷及硬腦膜)，定向注射Lactacystin 10 μg(2 μl生理鹽水溶解)，緩慢進(jìn)針，注射速度為0.5 μl/min，留針5 min，緩慢退針，縫合切口。正常對(duì)照組同部位注射等體積生理鹽水。

1.2.2藥物干預(yù)前大鼠行為觀察 觀察大鼠造模后第7、14、21天的行為改變：是否出現(xiàn)震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少等行為異常。在造模后第21天，大鼠出現(xiàn)了明顯的運(yùn)動(dòng)遲緩和活動(dòng)減少，部分大鼠出現(xiàn)震顫；隨機(jī)取模型復(fù)制組、正常對(duì)照組大鼠各(雄性)1只，進(jìn)行左側(cè)腦黑質(zhì)病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)模型復(fù)制組大鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，路易小體形成，見圖1，說明模型復(fù)制成功。

PD模型組

正常對(duì)照組

1.2.3分組與藥物干預(yù) 從造模后的第22天起，將60只模型復(fù)制組大鼠按性別、體重隨機(jī)均分為6組，分別為：模型組、獨(dú)活香豆素低劑量(正常量)組、獨(dú)活香豆素中劑量(3倍量)組、獨(dú)活香豆素高劑量(9倍量)組、美多巴組、布洛芬組。除模型組外，其余5組分別予以藥物干預(yù)，獨(dú)活香豆素低劑量組：獨(dú)活香豆素22.05 mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于獨(dú)活生藥(飲片)1.04 g·kg-1·d-1；獨(dú)活香豆素中劑量(3倍量)組：獨(dú)活香豆素66.15 mg·kg-1·d-1；獨(dú)活香豆素高劑量(9倍量)組：獨(dú)活香豆素198.45 mg·kg-1·d-1；美多巴組：美多巴26.05 mg·kg-1·d-1；布洛芬組：布洛芬62.5 mg·kg-1·d-1。模型組和正常對(duì)照組均為生理鹽水5 ml·kg-1·d-1。以上7組大鼠給藥途徑均為灌胃(體積相同)，干預(yù)21 d。

1.2.4藥物干預(yù)后大鼠行為學(xué)觀察與測定 觀察各組大鼠在藥物干預(yù)(灌胃)后第7、14、21天行為變化，重點(diǎn)觀察大鼠有無震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、活動(dòng)減少等行為異常。

藥物干預(yù)后的第21天(造模后第42天)進(jìn)行開野實(shí)驗(yàn)測定。開野實(shí)驗(yàn)箱：黑色敞口木箱，大小為60 cm×60 cm×40 cm，箱底劃分為25個(gè)方格(12 cm×12 cm /格)。將各組大鼠分別放入正中一格，10 s后開始記錄15 s內(nèi)大鼠下肢站立次數(shù)、嗅箱壁(鼻子距離箱壁5 cm以內(nèi))次數(shù)、穿梭距離等指標(biāo)。開野實(shí)驗(yàn)檢測期間實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暗光、安靜。

1.3指標(biāo)測定 給藥后第21天，停藥，禁食24 h，稱重。10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血2 ml，檢測血清T-SOD活性、MDA、Glu含量；同時(shí)在冰臺(tái)上，迅速取腦組織，檢測腦組織中MDA、Glu含量。MDA含量用硫代巴比妥酸法測定，Glu含量用比色法測定，血清T-SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測定，具體步驟均按試劑盒說明書操作。

2 結(jié) 果

2.1獨(dú)活香豆素對(duì)PD大鼠行為變化的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組、獨(dú)活香豆素高、中、低三個(gè)劑量組、美多巴組、布洛芬組大鼠下肢站立次數(shù)、嗅箱壁次數(shù)、穿梭距離均明顯減少(P<0.01 或P<0.05)；與模型組相比，獨(dú)活香豆素高、中、低三個(gè)劑量組、美多巴組、布洛芬組大鼠下肢站立次數(shù)、嗅箱壁次數(shù)、穿梭距離均明顯增多(P<0.01)。見表1。獨(dú)活香豆素高、中劑量組和美多巴組優(yōu)于獨(dú)活香豆素低劑量組和布洛芬組(P<0.01或P<0.05)，獨(dú)活香豆素高、中劑量組、美多巴組之間無差異(P>0.05)。

2.2獨(dú)活香豆素對(duì)PD大鼠血清、腦組織MDA、Glu含量的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組、獨(dú)活香豆素高、中、低三個(gè)劑量組、美多巴組、布洛芬組大鼠血清和腦組織MDA、Glu含量均明顯增多(P<0.01)；與模型對(duì)照組相比，獨(dú)活香豆素高、中、低三個(gè)劑量組、美多巴組、布洛芬組大鼠血清和腦組織MDA、Glu含量均明顯減少(P<0.01)。見表2、表3。獨(dú)活香豆素高、中劑量組和布洛芬組大鼠血清、腦組織MDA、Glu含量低于獨(dú)活香豆素低劑量組和美多巴組(P<0.01)，獨(dú)活香豆素高、中劑量組、布洛芬組間無差異(P>0.05)。

2.3獨(dú)活香豆素對(duì)PD大鼠血清T-SOD活性的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組、獨(dú)活香豆素高、中、低劑量組、美多巴組、布洛芬組血清T-SOD活性均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，獨(dú)活香豆素高、中、低三個(gè)劑量組、美多巴組、布洛芬組血清T-SOD活性均明顯增高(P<0.01)。見表2。獨(dú)活香豆素高、中劑量組和布洛芬組血清T-SOD活性高于獨(dú)活香豆素低劑量組和美多巴組(P<0.01)，獨(dú)活香豆素高、中劑量組、布洛芬組間無差異(P>0.05)。

表1 各組開野實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

表2 各組大鼠血清中T-SOD活性、MDA、Glu含量比較

表3 各組大鼠腦組織中MDA、Glu含量比較

3 討 論

目前PD發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，一般認(rèn)為與遺傳因素和環(huán)境因素密切相關(guān)，氧化應(yīng)激、抗氧化機(jī)制障礙、興奮性氨基酸毒性作用是其重要的發(fā)病機(jī)制之一。PD的治療藥物左旋多巴(L-Dopa)是金標(biāo)準(zhǔn)，可減輕癥狀，但不能減慢疾病的進(jìn)程，且長期使用會(huì)出現(xiàn)開關(guān)現(xiàn)象、運(yùn)動(dòng)障礙或精神改變等嚴(yán)重副作用。復(fù)方L-Dopa，如美多巴，是左旋多巴和芐絲肼1∶4 的混合制劑，但這類藥物長期服用也可產(chǎn)生類似左旋多巴的不良反應(yīng)。布洛芬等非甾體類藥物雖對(duì)PD有保護(hù)作用，但因其腸胃部不適或皮疹、頭痛、耳鳴等副作用，也非PD常規(guī)用藥。

SOD作為抗氧化酶，能清除超氧陰離子和自由基，是保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的第一道防線，其活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，如MDA、羥基、羰基等，從而引起細(xì)胞死亡。MDA作為體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物之一，可間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。有研究發(fā)現(xiàn)，在PD患者死后腦黑質(zhì)中，MDA及過氧化氫(H2O2)等脂質(zhì)過氧化物明顯增加〔4〕。針灸可使PD大鼠腦黑質(zhì)中降低的 SOD、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)上升至正常水平〔5〕。

興奮性氨基酸(EAA)是廣泛存在于哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸興奮傳遞、學(xué)習(xí)記憶形成及多種神經(jīng)變性疾病的發(fā)生。EAA包括L-Glu和L-天門冬氨酸(Asp)，Glu 含量最高。一些研究表明：(1)興奮性氨基酸(主要是Glu)的神經(jīng)毒作用可選擇性引起黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元變性〔6〕。EAA 作為神經(jīng)遞質(zhì)具有Ca2+依賴的釋放形式，Glu 的神經(jīng)毒作用主要由Ca2+介導(dǎo)，當(dāng)Glu 濃度增高時(shí)，形成對(duì)其受體，即N-甲基-D-天冬氨酸型(NMDA)受體的爆發(fā)性占領(lǐng)，NMDA 受體過度激活，會(huì)導(dǎo)致大量Na+、Ca2+持續(xù)內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體呼吸鏈功能受損；同時(shí)，Glu 還可通過激活NMDA 受體產(chǎn)生一氧化氮(NO)，后者對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有直接殺傷作用，從而導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的遲發(fā)性變性和壞死。(2)PD運(yùn)動(dòng)癥狀的出現(xiàn)是由于紋狀體DA能神經(jīng)元缺失，來自大腦皮質(zhì)的Glu能神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，致使紋狀體投射到蒼白球的興奮過度加強(qiáng)而產(chǎn)生〔7〕。(3)PD時(shí)黑質(zhì)神經(jīng)元存在線粒體功能障礙、能量代謝降低，DA能神經(jīng)元對(duì)Glu的敏感性增強(qiáng)〔8〕。(4)倫學(xué)慶等〔9〕認(rèn)為Glu參與了PD的發(fā)病過程，減少或阻斷興奮性氨基酸的釋放將有助于PD的治療。

關(guān)于PD動(dòng)物模型研究很多，蛋白酶抑制劑Lactacystin誘導(dǎo)的PD模型是目前公認(rèn)的、比較新的和理想的動(dòng)物模型〔2，10〕，它既能模擬出PD的慢性過程、行為學(xué)改變，又能模擬出黑質(zhì)部位神經(jīng)元變性、數(shù)量減少、Lewy小體形成等典型的病理特征，且效果穩(wěn)定，優(yōu)于其他PD動(dòng)物模型。

獨(dú)活是祛風(fēng)濕散寒類中藥，被列為該類中藥之首。獨(dú)活始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品。獨(dú)活主要用于治療風(fēng)寒濕痹痛及外感風(fēng)寒挾濕表證，對(duì)腰膝、腿足關(guān)節(jié)疼痛屬下部寒濕重者及腎氣虛弱，當(dāng)風(fēng)受冷所致偏枯冷痹緩弱疼痛等效果尤佳。但縱觀歷代醫(yī)家對(duì)中藥獨(dú)活的記載，可以發(fā)現(xiàn)獨(dú)活還具有調(diào)補(bǔ)五臟、尤補(bǔ)肝腎、祛瘀化痰、宣通腦絡(luò)之功，是一味入陰而升陽、通補(bǔ)并用的良藥。

現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，從獨(dú)活中可分離出29種香豆素類成分，它們具有抑制血小板聚集和血栓形成、抗心律失常、擴(kuò)冠、降壓、鈣拮抗、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、催眠、抗腫瘤、解痙、抗胃潰瘍等作用。我們前期研究已表明，獨(dú)活水煎劑、顆粒劑及醇提物對(duì)腦老化、阿爾茨海默病(AD)模型鼠具有延緩衰老的作用，并參與了多種抗衰老機(jī)制的調(diào)節(jié)〔11〕。

本研究結(jié)果提示：(1)應(yīng)用蛋白酶抑制劑Lactacystin腦內(nèi)定位注射制備的PD模型大鼠存在行為學(xué)異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)及興奮性氨基酸GLu異常增多等改變。(2)獨(dú)活香豆素能夠改善PD模型大鼠行為學(xué)異常、氧化應(yīng)激及興奮性氨基酸GLu的異常增多；在獨(dú)活香豆素三個(gè)劑量組中，以獨(dú)活香豆素中劑量組效量比高。(3)獨(dú)活香豆素對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)異常的改善，可能與其減少氧化應(yīng)激、增強(qiáng)抗氧化能力、減少興奮性氨基酸Glu的異常增多有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1梅加明，牛朝詩，陳建民，等.蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)帕金森病大鼠模型行為學(xué)退行性 中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2008；13(10)：466-9.

2包新民，舒斯云.大鼠腦立體定向圖譜〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：48-54.

3馬 駿，朱書秀.電針對(duì)帕金森病模型大鼠黑質(zhì)抗氧化酶的影響〔J〕.中國臨床康復(fù)，2005;5：120.

4Klockgether T，Loschmann P，Wulloner U.New medical and surgical treatments for Parkinson's disease〔J〕.Curr Opin Neurol，1994;7：346-51.

5劉振國，陳生弟，梁 梁，等.帕金森病模型猴細(xì)胞外液興奮性氨基酸含量變化〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，1999;18(1)：45-7.

6Atlante A，Calissano P，Bobba A，etal.Glutamate neurotoxicity，oxidative stress and mitochondria〔J〕.FEBS Lett，2001;497(1)：1-5.

7倫學(xué)慶，張春芬，章 翔.實(shí)驗(yàn)性帕金森病血漿及紋狀體興奮性氨基酸變化及其意義〔J〕.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1998;21(1)：21-3.

8McNaught KS，Bjoklund LM，Belizaire R，etal.Proteasome inhibition causes nigral degeneration with inclusion bodies in rats〔J〕.Neuroreport，2002;13(11)：1437-41.

9裴 媛，李德新，孫松輝.獨(dú)活及其醇提物對(duì)自然衰老小鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2005；25(8)：959.

10李海權(quán)，李德新，孫松輝.衰老小鼠腦組織mtDNA缺失呼吸鏈酶復(fù)合體活性的變化以及獨(dú)活作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)刊,2006；24(2)：241-3.

11金紅姝，李德新，孫松輝.獨(dú)活及其醇提物延緩腦老化機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志，2003；37(11)：54-6.