消癥活絡方藥對TGF-β1誘導HK-2細胞轉分化的影響

葉豆丹 郭淑婷 潘 志 劉慶彬 王穎航

(長春中醫(yī)藥大學研發(fā)中心，吉林 長春 130117)

慢性腎病(CKD)的發(fā)病率逐漸增加，由于其病程長、治療費用昂貴，給社會及家庭帶來經濟和精神上的負擔。腎纖維化是大多數CKD發(fā)展至終末期腎衰竭的共同通路，而且纖維化進程與腎衰竭等級相關〔1,2〕。逆轉或延緩腎纖維化進程成為治療CKD的突破口。腎纖維化過程中有多種細胞因子參與，如轉化生長因子(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)、信號傳導分子(Smad2)、Smad7等〔3～6〕。其中TGF-β1被廣泛認為是腎纖維化過程中的關鍵因子，任何一種CKD都能發(fā)現TGF-β1表達上調〔7〕。CTGF為TGF-β1下游調節(jié)因子，能夠增強TGF-β1的致纖維化效應〔8〕。本實驗以TGF-β1為刺激因子誘導腎小管上皮細胞(HK-2)細胞轉分化，通過細胞增殖試驗和免疫細胞化學等方法研究消癥活絡方藥對TGF-β1誘導HK-2轉分化的拮抗作用。

1 對象與方法

1.1試劑及儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱：SANYO公司；超凈工作臺：蘇州凈化公司；倒置顯微鏡：上海蔡康光學儀器有限公司；酶標儀：美國Thermo公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國GIBCO公司；胎牛血清(BSA)：HyClone公司；噻唑蘭(MTT)：美國SIGMA公司；TGF-β1：PEPROTECH公司；鹽酸貝那普利：北京諾華制藥有限公司；α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、CTGF及免疫組化試劑盒：武漢博士德公司，Wistar大鼠購自吉林大學動物部。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人近端HK-2常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：DMEM高糖培養(yǎng)基+10%BAS作為培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱溫度為37℃，CO2濃度為5%，0.25%胰蛋白酶+1%乙二胺四乙酸(EDTA)作為消化液用于細胞傳代。

1.2.2含藥血清制備 健康雄性Wistar大鼠30只，體重為230～280 g，隨機分為空白組、陽性組及中藥組，每組10只，每天清晨灌胃(其中空白組灌胃蒸餾水，陽性組灌胃鹽酸貝那普利溶液，中藥組灌胃消癥活絡方藥水煎劑)，給藥劑量按動物實驗等效劑量的折算方法換算，以最大劑量灌胃，連續(xù)給藥7 d，1次/d。最后一次給藥2 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h左右 ，1 000 r/min離心，取上層血清，合并同組血清，56℃滅活30 min，0.22 u濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3MTT法檢測HK-2增殖 HK-2細胞生長至對數期消化后，收集細胞制成細胞懸液，鏡下計數并調整細胞濃度為1×105后，接種于96孔板，同時接種3塊板，即24、48、72 h板。根據實驗預試每板分為空白對照組、TGF-β1組、消癥活絡方藥5%含藥血清組(方藥1組)、消癥活絡方藥10%含藥血清組(方藥2組)、陽性對照鹽酸貝那普利含藥血清組(陽性對照組)；每組6個復孔，100 μl/孔。細胞長滿孔底后換無血清DMEM培養(yǎng)基同步24 h。細胞同步后棄掉上清液，按以上分組加入受試物，分別于給藥后4、24、48、72 h用MTT法檢測細胞增殖，實驗重復3次。

1.2.4免疫細胞化學法檢測α-SMA及CTGF表達 取對數生長期細胞，制成細胞懸液，鏡下計數并調整細胞濃度至1×105，將高壓滅菌的細胞爬片置于6孔板內，將細胞懸液鋪于細胞爬片上，100 μl/片，面積盡量大但不能超出爬片，置于CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4～5 h使細胞貼壁，每孔補加2 ml培養(yǎng)基，換無血清培養(yǎng)基同步24 h，棄掉上清液。根據實驗預試每板分為空白對照組、TGF-β1組、消癥活絡方藥含藥血清組、陽性對照含藥血清組。收集細胞爬片，免疫組化法檢測α-SMA及CTGF表達率。按免疫組化試劑盒說明操作，10%甲醛固定30 min，空氣干燥5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.2～7.6)洗2 min 3次。30%H2O2加純甲醇50份混合，室溫浸泡30 min，蒸餾水洗2 min 3次。滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，甩去多余液體，不洗。滴加α-SMA(1∶50稀釋)或CTGF(1∶50稀釋)，4℃過夜，PBS洗2 min 3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20℃～37℃ 20 min，PBS洗2 min 3次。滴加鏈霉素和素-生物素復合物(SABC)試劑，20℃～37℃ 20 min，PBS洗5 min 4次。二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蒸餾水洗滌。蘇木素輕度復染。脫水、透明、封片。每組隨機選取5個視野計算陽性表達率。

2 結 果

2.1MTT比色法檢測清癥活絡方藥對TGF-β1誘導HK-2增殖的影響 各組OD值均比TGF-β1組小(P<0.05)，消癥活絡方藥血清組和陽性對照含藥血清組OD值均較TGF-β1組小(P<0.05)。見表1。

表1 MTT比色法檢測消癥活絡方藥對TGF-β1誘導的HK-2增殖的影響

2.2免疫細胞化學法檢測α-SMA和CTGF表達結果 空白組基本未見α-SMA表達,細胞形態(tài)呈鋪路石樣,TGF-β1處理組細胞在48 h開始出現明顯的形態(tài)改變,大量細胞由立方鋪路石樣轉變?yōu)樗笮烷L條狀,細胞肥大,72 h更加明顯,72 h進行免疫細胞化學染色見大量細胞胞漿內強烈表達α-SMA。TGF-β1組的α-SMA和CTGF陽性細胞很明顯多于空白對照組(P<0.05)，消癥活絡方藥組和陽性對照含藥血清組明顯少于TGF-β1組和空白組(P<0.05)。見表2。

表2 消癥活絡方藥對TGF-β1誘導的HK-2細胞α-SMA和CTGF表達的影響

3 討 論

TGF-β1是公認的促纖維化因子〔9〕，5 ng/ml的TGF-β1刺激HK-2細胞，可誘導其增殖〔10〕。本實驗結果也證明了這一點，可見消癥活絡方藥可抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞增殖。肌成纖維細胞被稱為腎纖維化的關鍵媒介，其被TGF-β1等細胞因子活化后分泌細胞外基質，如膠原蛋白和纖維連接蛋白〔11〕。α-SMA被認為是肌成纖維細胞的標志蛋白〔12〕，可以作為診斷腎纖維化程度的標準。正常HK-2細胞基本不表達α-SMA，當TGF-β1刺激后，發(fā)生小管上皮細胞向間充質細胞轉化(EMT)作用，轉化為肌成纖維細胞，隨著纖維化程度加重肌成纖維細胞增多，進而α-SMA表達增加。 EMT 主要包括下列4 個關鍵步驟〔13〕:(1)上皮細胞失去細胞間連接的特性；(2)新合成并表達α- SMA，以及細胞骨架蛋白肌動蛋白質actin的重新構建;(3)組織基底膜完整性破壞;(4)細胞遷移和浸潤能力增強等。EMT已經被證實是腎臟纖維形成的最初機制〔14〕。CTGF是TGF-β1的下游作用因子，TGF-β1活化可以增加CTGF表達，而CTGF可以刺激肌成纖維細胞增殖并能增加ECM合成，推動TGF-β1誘導的纖維化進程，被稱為成纖維細胞的引誘物。CTGF還可以從其他途徑產生，直接并獨立地誘導EMT〔15〕。本實驗結果證實TGF-β1可以刺激HK-2細胞表達α-SMA和CTGF，發(fā)生小管上皮細胞向間充質細胞轉化的作用，另外消癥活絡方藥可在一定程度上拮抗EMT作用。消癥活絡方藥含藥血清顯著減少了表達CTGF的陽性細胞數，空白血清卻無此作用，所以推斷CTGF是消癥活絡方藥拮抗EMT的一個作用點，可能通過TGF-β1/Smads途徑，減少CTGF的產生進而抑制肌成纖維細胞增殖并減少細胞外基質(ECM)合成，從而減輕腎纖維化的程度。

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