痛瀉要方對潰瘍性結腸炎模型大鼠結腸組織中NF-κB p65基因和蛋白表達的影響

朱向東 曹燕飛 王 燕 段永強

(甘肅中醫學院基礎課部，甘肅 蘭州 730000)

潰瘍性結腸炎(UC)是以腹痛腹瀉、黏液膿血便持續或反復發作為主要癥狀的腸道慢性非特異性炎癥。該病發病原因及機制尚不明確，復發率高，且有癌變傾向，目前尚缺乏滿意的治療方法，已被列為現代難治病之一〔1，2〕，因此，有關其病因病機的探討以及治療藥物的研發已成為近年來的研究熱點。筆者臨床上用痛瀉要方加減治療該病，取得了顯著療效。前期藥效學研究證實痛瀉要方能有效改善UC黏膜炎癥、促進潰瘍的修復，但作用機制不清。NF-κB是一種多功能核轉錄因子，具有廣泛的生物學活性，在機體免疫炎癥反應中起重要作用。已有動物實驗證實〔1〕，NF-κB p65的表達與UC的發病密切相關，但目前對于NF-κB p65與UC的關系研究還不夠深入，NF-κB p65在腸道炎癥中的作用機制還不十分清楚。本實驗在前期研究的基礎上進一步探討痛瀉要方對UC大鼠模型結腸黏膜NF-κB p65蛋白和基因表達的影響，以期探討痛瀉要方的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 采用SPF級Wistar大鼠60只，體質量(180±10)g，雌雄各半，由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供，SPF級動物質量合格證號：SCXKC(甘)2004-0006；SPF級實驗設施合格證號：SYXKC(甘)2004-0006-0001561。

1.1.2試劑 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)：購于北京邦定泰克生物技術有限公司，由美國sigma公司生產，批號為〔2008-16-2〕； TRIzol試劑(批號19919)、瓊脂糖(批號0000101394)均購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒(批號0000007526)、PCR試劑盒(批號108030404)均購自Promega Corporation。一抗NF-κB p65 (北京博奧森生物工程開發有限公司)；SP免疫組化染色試劑盒(北京博奧森生物工程開發有限公司)；DAB染色試劑盒(北京博奧森生物工程開發有限公司)。

1.1.3儀器與設備 美國BIO-RAD S1000TM型PCR儀；美國BIO-RAD 凝膠成像儀、電泳槽、電泳儀等；美國Bio-RAd核酸定量分析儀；德國3-16PK型通用臺式高速離心機、海爾DM-86L626型立式超低溫冰箱等；成都太盟BI-2000圖像分析系統之免疫組化分析系統。

1.1.4受試藥物 痛瀉要方由4味藥物組成。按原方3∶2∶1∶1的比例取陳皮、白術、白芍、防風，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取藥渣。合并3次醇提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇后得醇提取濃縮液，干燥得干膏，干膏粉碎成細粉，加入揮發油。實驗用不含賦形劑的浸膏，冰箱保存備用。柳氮磺胺嘧啶(SASP):上海信誼嘉華藥業有限公司，批號：H31020557。

1.2方法

1.2.1造模方法 采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將Wistar大鼠60只，禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用橡膠輸液管輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內，留置數分鐘。然后用針頭抽取一定量的空氣，同樣的方法注入大鼠腸腔，防止溶液外漏，讓動物保持平躺狀態，自然清醒；空白組10只大鼠也采用同樣方法用等量的生理鹽水灌腸。

1.2.2分組與給藥 將實驗動物分為6組：空白組、模型組和痛瀉要方低、中、高劑量組及SASP組，每組10只。除空白組外均以100 g/kg TNBS加50%乙醇0.25 ml混合試劑灌腸。痛瀉要方低、中、高劑量組分別按生藥11、22、44 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的5、10、20倍折算)，SASP組按0.3 g/kg劑量灌胃，灌胃體積均為10 ml/kg，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水。各組于造模后第2天開始灌胃，1次/d，連續21 d。3 w后處死，取標本。

1.2.3取材 大鼠禁食24 h(不禁水)后，脫頸椎法處死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛門以上8 cm處結腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷PBS緩沖液沖洗腸內容物，肉眼觀察各組大鼠腸組織大體形態情況記錄并進行評分。取病變最明顯處0.5 cm左右結腸組織，迅速移至液氮中保存，用于基因表達檢測。大體形態損傷評分參照Luketal標準進行：0分：無損傷；1分：充血但沒有潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍；3分：有1處小潰瘍，直徑約0～1 cm；4分：潰瘍較大，直徑約1～2 cm，但腸管與外周臟器無粘連；5分：潰瘍直徑1～2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴重。

1.2.4免疫組織化學法檢測PPAR-γ蛋白表達 采取經典的 SABC法，將固定好的石蠟切片常規脫蠟至水。每張切片滴加3% H2O2，室溫放置10 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)中進行抗原熱修復，自然冷卻至室溫，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。分別滴加NF-κBp 65一抗，4℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃培養箱中孵育20 min。滴加試劑SABC，在37℃培養箱中孵育20 min。DAB顯色劑，蘇木素輕度復染3 min；經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察結果，拍片。染色對照：同一組片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步驟同上。

NF-κB p65蛋白表達結果判定及測量方法：NF-κBp65蛋白主要表達于大鼠結腸組織中的腸道黏膜及黏膜下層，以胞質為主。NF-κB p65表達陽性為胞質呈黃綠顆粒染色，顏色越深，表達越強；未出現黃綠顆粒為陰性。采用BI-2000圖像分析系統之免疫組化分析系統，隨機選取5個視野，測量陽性細胞平均灰度值。灰度值大，蛋白表達多，反之則表達少。

1.2.5RT-PCR法檢測NF-κB p65 mRNA的表達 總RNA的提取采用經典的Trizol法，應用Bio-RAd核酸定量分析儀測定總RNA的濃度和純度，確保2.0>A260 nm/A280 nm>1.8。參照逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，合成cDNA。用cDNA模板對大鼠內參照β-actin及NF-κB p65基因分別進行PCR擴增。引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，內參照β-actin引物序列為:上游引物:5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，下游引物：5′-AAGGGTGTAAAACGCAGCTC-3′，擴增產物長度292 bp；NF-κB p65引物序列為:上游引物：5′- GAGCAAGCCATTAGCCAGCG -3′，下游引物：5′- CACGGTTATCAAAAATCGGA -3′，產物長度173 bp。擴增反應體系為50 μl，其中cDNA 5 μl；上下游引物各1 μl；MgCl23 μl；10×Reaction Buffer 5 μl；dNTP Mix 1 μl；Tap DNA聚合酶 0.25 μl；無酶水補足至50 μl。擴增參數為:預變性95℃ 2 min，95℃變性45 s，退火52℃ 45 s，72℃延伸30 s，共32個循環(β-actin為25個循環)，總延伸72℃ 5 min。PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像儀上成像，采用QuantityOne圖像分析軟件分析數據，獲得各電泳條帶的積分光密度(X)，用β-actin的積分光密度(A)作為內參照，計算基因的相對表達量(X/A)作為實驗數據。

2 結 果

2.1一般狀態 模型組大鼠在造模當天開始出現稀便，覓食較不主動，食量減少，肛周污濁；于1 w內體重有所下降，毛色晦暗無光澤且被糞便沾染，持續稀便，部分大鼠有血便且肉眼可見，各治療組中痛瀉要方低、中劑量組癥狀緩解較慢，毛色仍稍顯晦暗無光澤，食量較少，扎堆、稀便及血便癥狀緩解不明顯，不活躍；痛瀉要方高劑量組、SASP組隨著給藥時間的持續，癥狀明顯好轉，大部分大鼠稀便癥狀消失，基本恢復正常，糞便呈灰褐色顆粒狀，毛色逐漸轉為光亮潤澤，食量正常，活躍，體重增長。各治療組中以痛瀉要方高劑量組和SASP組癥狀改善最為明顯。

2.2結腸黏膜損傷情況 模型組大鼠結腸黏膜可見明顯的充血、水腫、潰瘍，腸壁變厚、腸道縮短。經痛瀉要方及SASP治療后大鼠結腸黏膜損傷情況均明顯改善，但各組具體情況不相同，其中痛瀉要方高劑量組及SASP組各大鼠黏膜僅有少量的充血水腫，其余損傷恢復正常。痛瀉要方高劑量組、SASP組與模型組比較，評分明顯降低(P<0.01)。痛瀉要方各治療組隨著劑量的增加，評分逐漸降低，痛瀉要方高劑量組與SASP組相比較，評分差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3NF-κB p65蛋白表達的檢測結果 空白組NF-κBp65蛋白少量表達。模型組表達較多，陽性細胞數量較多；SASP組表達較弱，數量較少。痛瀉要方低劑量組表達中等，陽性細胞數量中等。痛瀉要方高劑量組和中劑量組NF-κB p65蛋白表達較弱，陽性細胞數量較少，與SASP區別不大。陽性細胞平均光密度值結果見圖1，表1。

2.4RT-PCR 半定量結果 空白組大鼠結腸黏膜NF-κB p65的表達(0.58±0.29)處于較低水平，用TNBS/乙醇灌腸造模后NF-κB p65表達量顯著升高(P<0.01)，經痛瀉要方治療后與模型組(1.45±0.56)比較，NF-κB p65的表達水平降低(高、中、低劑量組分別為0.80±0.29、0.87±0.21、1.02±0.33)(P<0.05、P<0.01)，SASP組為0.85±0.27，圖2。

圖1 NF-κB p65蛋白表達(DAB，×40)

表1 痛瀉要方對UC大鼠結腸黏膜損傷評分及NF-κB p65蛋白表達水平的影響

Tg：痛瀉要方高劑量組；Tz：痛瀉要方中劑量組；Td：痛瀉要方低劑量組；B：空白組；S：SASP組；Mo：模型組

3 討 論

UC是一種與免疫直接相關的腸道慢性非特異性炎癥性疾病，臨床表現以腹瀉、黏液膿血便、腹痛、里急后重等癥狀為主。病變可見潰瘍和炎癥，主要局限在結腸黏膜及黏膜下層，多累及遠端結腸和直腸。本病反復發作、治愈難度大，容易惡化和癌變，給患者帶來巨大痛苦。西醫治療UC以氨基水楊酸制劑、糖皮質激素和免疫抑制劑為主，但效果不甚理想且容易復發〔1〕。其病因和發病機制研究多認為與環境、遺傳、感染等因素有關。中醫藥治療UC有明顯優勢，在中醫辨證論治思想的指導下，其臨床療效顯著。很多經典方劑，如烏梅丸、白頭翁湯、痛瀉要方等經典方劑已被臨床研究證明有顯著療效〔2〕。但在實驗研究中，研究者多關注結腸炎患者寒熱錯雜、濕熱內蘊的中醫病機，而對患者精神情志的紊亂導致病情加重關注較少。筆者在臨床和前期實驗研究發現，很多UC患者因為病程長、病情重、精神壓力大，導致肝氣郁結，肝郁脾虛而出現精神心理癥狀，而采用具有疏肝健脾功效的痛瀉要方治療，能取得顯著療效。

NF-κB是一種具有多向性轉錄調節作用的核蛋白因子，廣泛存在于各種組織中，在炎癥反應和免疫、病毒感染、細胞生長等方面發揮重要作用〔3〕。有功能活性的NF-κB二聚體大都含p65亞單位，這樣的二聚體具有顯著的促炎活性。目前已有研究證實UC中炎癥因子分泌的重要調控者之一就是含p65的NF-κB二聚體的激活〔4〕。UC的發病與NF-κB p65的表達密切相關〔5〕，NF-κB p65參與UC發病的可能機制是：當NF-κB p65被活化后，可以直接調節一系列炎癥細胞因子、黏附分子等的基因轉錄以及蛋白質合成，使這些炎癥遞質釋放增加，導致結腸黏膜的病理損傷〔6〕。另外，當脂磷壁酸、肽聚糖、脂多糖等抗原與腸道抗原提呈細胞PPRs(NOD、TLRs等)相結合，一方面NF-κB信號通路被激活〔7，8〕，能自身分泌細胞因子，另一方面則啟動腸道獲得性免疫，被激活的免疫細胞產生腫瘤壞死因子、白介素、干擾素等炎癥因子，而這些炎癥因子又可以反作用于NF-κB信號通路，使更多的NF-κB蛋白轉移到核內，調控多種炎癥因子相關基因的表達，進一步使腸道炎癥反應加重，所以如果能阻止NF-κB信號通路的開放，就可能十分有效地治療腸道炎癥〔9～11〕。

本實驗結果表明，空白組大鼠結腸黏膜中NF-κB p65蛋白和基因表達較弱。模型組大鼠結腸黏膜中NF-κBp65蛋白和基因表達量升高，說明在UC發病時，NF-κB信號通路可能已被激活。而治療組NF-κB p65蛋白和基因表達量又明顯低于模型組，說明痛瀉要方可能具有阻止NF-κB信號通路開放的效用。本實驗還證實NF-κB p65蛋白和基因表達量與結腸黏膜組織的損傷程度呈正相關，也支持上述研究結果。上述研究結果表明，NF-κBp65的激活參與了UC的發病。痛瀉要方治療UC的作用機制可能是發揮疏肝健脾的整體調節作用，起到了激活NF-κB p65的效用。其具體作用機制可能是通過降低NF-κB p65mRNA轉錄水平，調控NF-κB p65蛋白的表達量，發揮抑制NF-κB p65合成的作用，使NF-κB p65在蛋白水平的表達減少，一方面可能通過抑制阻止NF-κB信號通路的開放發揮其在UC中的抗炎作用，也可能是調控NF-κB的活化，抑制多種炎癥細胞因子的釋放和表達發揮抗炎作用，其相關作用機制有待進一步研究。

4 參考文獻

1何小華，陳建勇.炎癥性腸病發病的相關免疫機制〔J〕.南昌大學學報(醫學版),2011；51(10)：93-5.

2路曉紅，楊恩來，趙 霞，等.潰瘍性結腸炎免疫機制的研究進展〔J〕.山西中醫學院學報，2011；12(1)：66-8.

3李 楠，王雪明，翟俊山，等.復方血竭對潰瘍性結腸炎大鼠模型結腸組織細胞因子的調節作用〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2008；14(1)：53-4.

4張善金，李弼民.NF-κB信號通路與炎癥性腸病〔J〕.世界華人消化雜志，2011；19(5):505-9.

5盧 健，馬 驥，王麗娜，等.四逆散對實驗性潰瘍性結腸炎大鼠IL-1β的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2011；17(1)：103-5.

6Tjandra K，Le T，Swain MG.Experimental colitis attenuates development of toxin-induced cholangitis in rats〔J〕.Dig Dis Sci，2002；47：1216.

7鄧 輝，欽丹萍.中醫藥對潰瘍性結腸炎細胞因子的干預研究〔J〕.中國中西醫結合消化雜志，2006；14(5):344-6.

8Li Z，Zhang DK，Yi WQ，etal.NF-kappaB p65 antisense oligonu cleotides may serve as a novel molecular approach for the treatment of patients with ulcerative colitis〔J〕.Arch Med Res，2008；39(8):729-34.

9何 雁，王志紅，楊善峰，等.TLR9和NF-κB p65在大鼠潰瘍性結腸炎模型結腸組織中的表達〔J〕.安徽醫藥，2012；16(7)：938-40.

10杜立陽，陳銘詩，劉清芳，等.復方青黛顆粒對潰瘍性結腸炎大鼠NF-κB P65、TNF-α表達的影響〔J〕.世界華人消化雜志，2011；19(12):1290-4.

11榮英蕊，劉建平，陳建權，等.泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織NF-κB p65及ICAM-1表達的影響〔J〕.上海中醫藥雜志，2010；44(3)：63-5.