滋腎益腦方對腎陰虛抑郁模型大鼠腦源性神經營養因子、酪氨酸激酶受體B基因表達的影響

秦莉花 李 晟 陳曉陽 秦莉峰 方 晗 吳艷飛 黃 寬

(湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208)

抑郁癥(DEP)以顯著持續性心境低落為主要特征，同時也存在認知功能改變和其他精神癥狀、食欲、睡眠障礙以及自主神經功能紊亂、特發性疼痛等伴發癥狀。世界衛生組織研究顯示，在全球神經精神疾病的負擔中，預測到2020年DEP將成為僅次于冠心病的第2位疾病負擔源〔1〕。因此，應該加強對DEP的防治意義重大。由于長期的情志不暢損傷肝腎，耗傷陰精致骨髓失充、髓海失養，腦神不得伸展而成郁，故肝腎陰虛導致的DEP甚為常見，尤多見于疾病中、后期及老年人群。本文通過采用輕度不可預見性的應激模型+甲狀腺素的方法，造成大鼠抑郁陰虛狀態，觀察滋腎益腦方對腎陰虛大鼠抑郁模型大鼠行為學及腦源性神經營養因子(BDNF)、酪氨酸激酶受體B(TrKB)基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物 健康SD大鼠，雌雄各半，體重170～190 g(購自長沙開福區東創科技服務部)。

1.2藥物及試劑 滋腎益腦方臨床用量為80 g/d，按處方稱取藥材(湖南中醫藥大學附屬醫院提供熟地15 g，何首烏15 g，郁金10 g，丹參15 g，當歸15 g，石斛10 g等)，水煎2次，過濾，合并濾液，濃縮成相應濃度(浸膏)，4℃保存備用；鹽酸氟西汀膠囊(PATHEON France，批號：0972A)；甲狀腺素片(濟南維爾康生化制藥有限公司，批號：05055050)；瓊脂糖(西班牙)，DL2000 DNA Marker、dNTP(Genstar)，引物(上海生工)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Fermentas)，EDTA、Tris(Sigma)，Taq酶(Genstar)。

1.3儀器 敞箱 (自制)由不透明材料制成，底面為100 cm×100 cm的正方形，被等分為25個等邊方格，高50 cm；電子天平(型號：ES-C-600電子天平，湘儀天平儀器有限公司)；低溫大容量離心機(中國科學技術大學科技實業有限公司型號：KDC-2046)；PCR儀(eppendorf公司)，電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽(北京六一公司)。

1.4方法

1.4.1分組 動物分組試驗前，進行敞箱試驗和液體消耗試驗，根據敞箱試驗和液體消耗試驗的結果篩選大鼠，共40只，結合前期試驗結果滋腎益腦方中、高劑量組抗抑郁療效優于低劑量組，故本實驗隨機分為5組：正常組、模型組、鹽酸氟西汀組(氟西汀組)、滋腎益腦方中劑量組(中劑量組)、滋腎益腦方高劑量組(高劑量組)，每組8只。

1.4.2造模 參考文獻〔2～4〕進行造模，采用灌胃甲狀腺素合并慢性輕度，不可預見性應激法，建立“腎陰虛抑郁病證”復合模型。造模方法：將4℃冰水游泳5 min，禁食禁水24 h，夾尾1 min，明暗顛倒24 h，陌生物品(如塑料杯、碎布頭等)，潮濕墊料、鼠籠傾，40℃高溫環境，電擊足底(18 V)，Morris水迷宮。共8種刺激隨機安排在21 d中，每日1種，使大鼠不能預料刺激發生，以避免產生適應性。同時，每日灌胃甲狀腺素2.5 mg·kg-1·d-1，造成大鼠抑郁+腎陰虛狀態。各組從實驗第7日起，氟西汀組給予鹽酸氟西汀3.6 mg·kg-1·d-1；滋腎益腦方中、高劑量分別給予滋腎益腦方14.4、28.8 g 生藥·kg-1·d-1；正常組與模型組均灌胃等容量蒸餾水。各組灌胃容量均為10 ml·kg-1·d-1，1次/d，連續14 d。除正常組外均單籠飼養。

1.4.3一般狀態及體重變化 觀察模型動物一般狀態及體重變化實驗過程中觀察大鼠外表、性情、活動情況、飲水量、大便情況，每周測1次體重。

1.4.4液體消耗試驗〔2,3〕試驗前，在隔噪音、安靜的房間內，訓練動物適應含糖飲水，每籠同時放置2個水瓶，第1個24 h，兩瓶均裝有1%蔗糖水，隨后的24 h，1個瓶裝1%蔗糖水，1個瓶裝純水。23 h禁食禁水后，進行動物的基礎糖純水消耗試驗，同時給予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。60 min后，取走2瓶并稱重。計算動物的糖水偏愛(糖水消耗量/總液體消耗×100%)。

1.4.5敞箱試驗〔2,3〕安靜的房間內進行此項試驗觀察。將大鼠置于中心方格內，觀察大鼠5 min內中央格停留時間(S)、穿越格數(四爪均進入的方格方可記數，為水平運動得分)、后肢直立次數(兩前爪騰空或攀附墻壁，為垂直運動得分)、清潔運動記數、糞便粒數。徹底清潔敞箱后再進行下1只大鼠的觀察。每只觀察1次。每周進行1次敞箱試驗。

1.4.6BDNF、TrKB基因表達的檢測

1.4.6.1RNA提取 每組取3只進行測定。海馬總RNA采用Trizol 1次性抽提法。取大鼠左側海馬置入1 ml Trizol中，冰上勻漿，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩后離心，取上清加等體積異丙醇，-20℃靜置20 min，低溫離心，沉淀中用75%乙醇洗，低溫離心，去上清，空氣干燥5～10 min，加50 μl DEPC處理水溶解沉淀，紫外分光光度計測定濃度。經凝膠電泳鑒定，兩條rRNA(18 S、28 S)條帶清晰，紫外分光光度計測A260/A280比值于1.8～2.0之間用于以下實驗。

1.4.6.2逆轉錄反應體系 在20 μl逆轉錄反應體系中，RNA樣品約3 μg，1 μl自由引物，5×反應緩沖液4 μl，RNase抑制劑1 μl，dNTP 2 μl，M-MLV逆轉錄酶(200 units)1 μl，42℃，1 h 30 min；72℃反應10 min。所得cDNA于-20℃凍存。

1.4.6.3引物設計 根據GenBank中目的基因所對應的cDNA表達序列和提供的相關資料，利用軟件Primer Premier 5.0設計上下游引物。①BDNF引物(產物長度為550 bp)：正義鏈：GTTATTTCATACTTCGGTTGC，反義鏈： TGGGATTACACTTGGTCTCG；②TrKB 引物(產物長度為148 bp)：正義鏈：GGCTTATGCTTGCTGGTC，反義鏈：CTGGGTCAATGCTGTTAGGT。

1.4.6.4PCR擴增 取1 μl cDNA上、下游引物各0.5 μl，Taq DNA聚合物0.15 μl，加入10 μl反應體系中擴增：(1)BDNF：反應條件為94℃，先變性4 min，然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環，最后72℃ 5 min。(2)TrKB：反應條件為94℃，先變性4 min，然后94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環，最后72℃ 5 min。

1.4.6.5PCR產物的分析 經凝膠成像及圖像分析系統掃描后，以大鼠海馬β-actin為參照，求出其相對灰度值。

2 結 果

2.1滋腎益腦方對抑郁大鼠體重及行為學指標的影響 實驗前，各組動物測得的體量、敞箱實驗、液體消耗試驗各項指標相近(P>0.05)。治療14 d(應激第21天)，與正常組比較，模型組體重、敞箱實驗、液體消耗試驗各項指標差異均有顯著性(P<0.01)，提示抑郁模型復制成功。與模型組比較，敞箱試驗中氟西汀組、滋腎益腦方中、高劑量組在各項指標上差異均有顯著性(P<0.01)，說明滋腎益腦方能改善模型動物的抑郁行為。與氟西汀組比較，滋腎益腦方各劑量組各指標無統計學差異；中劑量組的體重、糖水偏好均明顯增加，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠行為學指標的比較

2.2滋腎益腦方對抑郁大鼠BDNF基因表達的影響 在治療14 d(應激第21天)后，與正常組比較，模型組大鼠BDNF的mRNA表達明顯降低(0.550±0.62 vs 0.729±0.311，P<0.05)；與模型組比較，氟西汀組、滋腎益腦方中、高劑量組的BDNF mRNA表達升高(0.641±0.49，0.639±0.57，0.684±0.367)，但氟西汀組、滋腎益腦方中劑量組與模型組比較無明顯差異(P>0.05)，高劑量組與模型組比較有明顯差異(P<0.01)。滋腎益腦方組與氟西汀組大鼠海馬BDNF mRNA表達比較無明顯差異(P>0.05)，但海馬BDNF mRNA表達由高到低依次是高劑量組、氟西汀組、中劑量組。見圖1。

圖1 滋腎益腦方對抑郁大鼠BDNF mRNA表達的影響

2.3滋腎益腦方對抑郁大鼠TrKB基因表達的影響 在治療14 d(應激第21天)后，與正常組比較，模型組大鼠TrKB的mRNA表達明顯降低(0.245±0.023 vs 0.512±0.105，P<0.05)；與模型組比較，氟西汀組、憂慮康中、高劑量組的TrKB mRNA表達升高(0.447±0.031，0.401±0.078，0.453±0.03，P<0.05，P<0.01)。滋腎益腦方組與氟西汀組大鼠海馬TrKB mRNA表達比較均無明顯差異(P>0.05)，但海馬TrKB mRNA表達由高到低依次是高劑量組、氟西汀組、中劑量組。見圖2。

圖2 滋腎益腦方對抑郁大鼠TrKB mRNA表達的影響

3 討 論

目前DEP的病理生理及發病機制與海馬結構及功能變化等有密切關系。已有研究證實，慢性應激大鼠中可以導致海馬神經元萎縮、變性及死亡，且應激以及抑郁狀態使腦區神經元尤其是海馬區再生出現障礙，這可能是DEP發生的機制之一。

BDNF是一種主要的神經營養因子，在海馬和皮層中高水平表達，是神經元再生的關鍵因素〔5，6〕。研究證據表明BDNF表達水平下降參與DEP的某些病理生理過程。TrKB是BDNF的特異的功能受體，BDNF的作用必須通過TrKB實現。TrKB是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的一種神經營養素家族高親和力受體，廣泛分布于中樞神經系統，對神經元的生存、生長、分化有重要的影響〔7〕。TrKB主要作為神經營養素家族中BDNF和神經營養因子4/5(NT-4/5) 的特異性高親和力受體。

外源性DEP大鼠(應用慢性溫和性刺激制備)及成年內源性DEP大鼠(幼鼠腹腔注射五羥色胺再攝取抑制劑-氯米帕明制備)模型，與正常對照組相比，內、外源性DEP大鼠腦內BDNF水平均較正常組大鼠明顯降低〔8〕。免疫組化法檢測抑郁模型大鼠海馬CA3區BDNF含量及表達的總面積、陽性細胞數和平均光密度均明顯降低〔9，10〕。張大鵬等〔11〕研究發現，慢性應激致大鼠前腦皮質細胞BDNF和TrKB表達減少，褪黑激素對其進行干預，大鼠相應地前腦皮質BDNF和TrkB的表達上調。本實驗研究與上述報道結果一致，以采用灌胃甲狀腺素合并慢性不可預見性應激制成腎陰虛抑郁動物模型后，模型組海馬區BDNF、TrKB的基因表達明顯下調，氟西汀、滋腎益腦方均可在對抗慢性應激引起的行為學變化的同時，使海馬區BDNF、TrKB基因表達明顯升高，滋腎益腦方高劑量組在BDNF、TrkB基因表達方面明顯尤于氟西汀、滋腎益腦方劑中量組。本文結果提示，肝腎陰虛抑郁模型腦內海馬區TrkB的表達減少，可能是神經細胞可塑性下降、細胞凋亡與再生平衡失調的原因之一，進而導致局部性結構和功能障礙，引起認知、情感等改變。滋腎益腦的作用機制之一可能是通過促進海馬BDNF、TrKB基因表達上調。

4 參考文獻

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