Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中的表達及與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關系

龍啟強 陶志堅 韓建波 趙 亮 易永祥

(東南大學附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 南京 210003)

多個研究發(fā)現(xiàn)，Hsa-miR-9在神經(jīng)腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、食管癌、淋巴瘤的腫瘤組織中表達上調(diào)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用〔1～6〕。本研究探討Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中的表達及與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關系，為進一步揭示結(jié)直腸癌發(fā)病機制和指導治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1病例標本 結(jié)直腸癌組織及腫瘤遠端切緣正常結(jié)直腸組織標本來自2004年1月至2007年6月在東南大學附屬第二醫(yī)院和東南大學附屬馬鞍山醫(yī)院初次就診且未合并其他腫瘤的結(jié)直腸癌手術患者66例，男44例，女22例；年齡38～77歲，平均58.34歲，中位年齡56歲。66例均為腺癌，高分化癌5例，中分化癌35例，低分化癌26例；病理pTNM(UICC2003分期標準)分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期31例，Ⅲ期21例，Ⅳ期8例。手術前均未接受放化療。所有標本液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2原位雜交檢測Hsa-miR-9的表達 將組織標本從液氮中取出，解凍后浸入經(jīng)DEPC處理的4%多聚甲醛中固定，過夜后將組織塊取出脫水、浸蠟包埋、切片。石蠟包埋的切片置80℃烘烤30 min，趁熱將切片放入二甲苯中脫蠟2次，每次10 min，然后依次放入100%酒精中浸泡5 min×2次、90%酒精、70%酒精，50%酒精中各浸泡5 min，原位雜交用PBS 漂洗5 min×3次。用3%的H2O2室溫下處理10 min，再用DEPC水漂洗3次。切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，室溫消化15～20 min，原位雜交用PBS漂洗5 min×3次，DEPC水漂洗1次。用經(jīng)DEPC處理的1%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS配制，pH7.4)室溫固定10 min，DEPC水漂洗3次。每張切片上滴加適量預雜交液，濕盒中56℃預雜交4 h。將miR-9探針按說明添加于預雜交液中，混勻，每張切片滴加適量雜交液，濕盒中56℃雜交過夜。然后，用預熱至37℃的2倍SSC漂洗5 min×2次，然后依次用0.5倍SSC，0.2倍SSC各漂洗15 min，可增加0.2倍SSC漂洗1次，以減少非特異性染色。滴加封閉液，室溫封閉30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛，室溫孵育2 h，原位雜交用PBS漂洗5 min×4次。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色程度，自來水沖洗終止反應。蘇木素復染2 min，自來水沖洗10 min，晾干后經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片〔7〕。

根據(jù)染色強度(0：無陽性染色；1：淺棕色；2：棕色；3：深棕色)和陽性細胞比例(0：0～5%；1：6%～30%；2：31%～60%；3：61%～100%)進行評分，每張切片隨機觀察8個高倍視野，確定染色強度和陽性細胞比例的評分乘積，取平均分值。評分結(jié)果判定標準為：(-)：0～1分，(+)：2～3分，()：4～6分，()：7～9分。和為高表達，-和+為低表達。所有標本均由兩位病理醫(yī)生獨立完成閱片。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織與腫瘤遠端切緣正常結(jié)直腸組織中的表達 原位雜交結(jié)果顯示，在癌組織中Hsa-miR-9的陽性信號強烈，多表現(xiàn)為彌漫性的細胞質(zhì)著色。66例結(jié)直腸癌組織中Hsa-miR-9高表達45例(68.18%)；66例腫瘤遠端切緣正常結(jié)直腸組織中Hsa-miR-9高表達10例(15.15%)，二者間有顯著差異(P=0.007)。見圖1。

結(jié)腸癌組織 正常結(jié)腸組織

2.2結(jié)直腸癌組織中Hsa-miR-9的高表達與臨床病理特征的關系 結(jié)直腸癌組織中Hsa-miR-9高表達與腫瘤分化程度、浸潤程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤部位、大體形態(tài)無關(P>0.05)。見表1。

3 討 論

人miR-9有23個核甘酸，有3種類型：miR-9-1、-2、-3，分別定位于1q22、5q14.3、15q26.1，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。miRNA的成熟過程需要兩種RNA內(nèi)切酶：Drosha和Dicer，Drosha主要存在于細胞核內(nèi)，能將pri-miRNA剪切成70 bp左右的pre-miRNA，pre-miRNA是莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可被Ran-GTP/Exportin 5輸出受體從細胞核傳送到細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)中pre-miRNA被Dicer酶切后成為miRNA，定位于細胞質(zhì)〔8，9〕。

miRNA表達改變可以導致遺傳信息表達的改變，從而導致相應的病理生理狀態(tài)，而處于一定病理生理狀態(tài)的組織常伴有特定的miRNA表達〔10〕。miR-9在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。對腫瘤miRNA表達研究有助于多種癌癥的分型和預后判斷〔11〕。

本實驗運用原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-9在結(jié)直腸癌組織中表達水平遠高于在正常腸組織中的表達水平，Hsa-miR-9表達與結(jié)直腸癌臨床分期之間有相關性，隨著結(jié)直腸癌的病情進展而表達增高。當腫瘤浸潤程度增加、分化程度惡化、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移時，癌組織中Hsa-miR-9的表達明顯升高，提示miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關。

4 參考文獻

1Ciafre SA，Galardi S，Mangiola A，etal.Extensive modulation of a set of microRNAs in primary glioblastoma〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005；334(4)：1351-8.

2Nass D，Renwald S，Meiri E，etal.MiR-92b and miR-9/9* are specifically expressed in brain primary tumors and can be used to differentiate primary from metastatic brain tumors〔J〕.Brain Pathol，2009；19：375-83.

3Lehmann U，Hasemeier B，Christgen M，etal.Epigenetic inactivation of microRNA gene hsa-mir-9-1 in human breast cancer〔J〕.J Pathol，2008；214(1)：17-24.

4Hu X，Schwarz JK，Lewis JS Jr，etal.A microRNA expression signature for cervical cancer prognosis〔J〕.Cancer Res，2010；70(4)：1441-8.

5Hu Y，Correa AM，Hoque A，etal.Prognostic significance of differentially expressed miRNAs in esophageal cancer〔J〕.Int J Cancer，2011；128(1)：132-43.

6Onnis A，De Falco G，Antonicelli G，etal.Alteration of microRNAs regulated by c-Myc in Burkitt lymphoma〔J〕.PLoS One，2010；5(9)：el2960.

7龔邵新，趙 強，莊英幟,等.Hsa-miR-9 在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.中國腫瘤臨床，2011；38(12)：720-2.

8Lee Y，Ahn C，Han J，etal.The nuclear RNaseⅢdrosha initiates microRNA processing〔J〕.Nature，2003；425：415-9.

9Kalting RF，F(xiàn)ischer SE，Bernstein E，etal.Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C.elegans〔J〕.Genes Dev，2001；15：2654-9.

10Cohn DE，F(xiàn)abbri M，Valeri N，etal.Comprehensive miRNA profiling of surgically staged endometrial cancer〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2010；202(6)：656,e1-e8.

11Cummins JM，Velculescu VE.Implications of micro-RNA profiling for cancer diagnosis〔J〕.Oncogene，2006；25：6220-7.