D-半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果

何 勝 玉 瑩 陳菊芳 張 元 潘福玉 李 海 梁雄壯 張樹球

(右江民族醫學院重金屬與氟砷毒物研究實驗室，廣西 百色 533000)

流行病學調查結果表明我國是世界上癡呆癥最多的國家之一〔1〕。由于它的病因、發病機制尚未清楚，因而尚無根治的藥物，已引起世界醫學界的關注及各國政府的重視。為研究疾病、發病機制和治療藥物，文獻中已建立有多種方法的動物模型，各有優點和不足〔2〕。本室陳莉等〔3〕也用何首烏制劑對D-半乳糖加亞硝酸鈉聯合造模小鼠進行治療實驗,獲得了較好的結果,但沒有進一步作大腦形態學變化的研究。本文仍用D-半乳糖加亞硝酸鈉聯合給小鼠皮下注射，建立動物模型后并將中藥復方首烏口服液和海爾福口服液分別用灌胃的方法給予治療，測定造模前后記憶能力變化,結束時測定血清和腦勻漿的生化指標及腦組織形態學變化。

1 材料與方法

1.1試劑 D-半乳糖、亞硝酸鈉、氯化鈉，均為國產分析純。乙酰膽堿酯酶(AchE)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒、總巰基(-SH)測試盒、甘油三酯(TG)測試盒、總膽固醇(TC)測試盒、鈣離子測試盒，購自南京建成生物工程研究所和四川省邁克科技有限責任公司。

1.2中藥 海爾福口服液，由銀花、茯苓、甘草等中藥提取制成。復方首烏口服液，由何首烏(制)、龍眼肉提取制成。均由本院海爾福研究中心提供。

1.3實驗動物及分組 選用昆明種小白鼠48只，鼠齡2個月，健康，雌雄各半，分成四個組，每組12只。即正常組、模型組、治療1組、治療2組。分籠喂養，雌雄分開，每籠6只，小鼠編號，稱體重。由學院動物室提供。

1.4AD模型的建立及治療 模型組、治療1組、治療2組均為造模組。D-半乳糖用生理鹽水溶解，配成9.8 mg/ml濃度，濾膜過濾除菌。放4℃冰箱保存待用。D-半乳糖按每天100 mg/kg體重劑量、亞硝酸鈉按45 mg/kg體重劑量〔3〕，兩溶液混合后作頸后皮下注射，每天1次，連續45天結束。造模到2 w后，治療組開始治療，治療1組用海爾福口服液，取原液0.2 ml用蒸餾水稀釋至0.4 ml灌胃，每天1次；治療2組用復方首烏口服液，取原液0.2 ml用蒸餾水稀釋至0.4 ml灌胃，每日1次。模型組和正常組用等體積的蒸餾水代替，方法相同，直至實驗結束。

1.5測定方法 AchE根據本酶催化乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，膽堿可與巰基顯色劑反應生成對稱三硝基苯(TNB)黃色化合物，顏色深淺進行比色定量，水解產物膽堿的數量反映一線膽堿酯酶的活力。具體操作參考試劑盒說明書。GSH-PX活力測定根據GSH-PX催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應，用GSH被消耗的量來計算GSH-PX活力，具體操作參考試劑盒說明書。-SH測定用巰基顯色劑顯色反應(黃色)，412 nm波長比色測定。鈣離子測定利用鈣離子與甲基百里香酚藍(MTB)結合，生成藍色絡合物，比色測定。TG用GPO-PAP法、TC用COD-CE-PAP法測定，具體操作參考試劑和說明書。水迷宮游水時間測定，利用y型水迷宮，開始預先訓練5天，每天游水訓練3次，使其熟悉上岸地點(逃命)，計算下水到達上岸地點時間(s)和錯誤率。統計時把超過10 s以上按10 s計，參考文獻〔4〕。

1.6統計學處理 數據用SPSS10.0統計學軟件進行方差分析，Q檢驗。

2 結 果

2.1各組-SH,AchE,GSH-PX測定結果 治療1組腦-SH活性最高，其余3組差異不明顯； AchE活性最低是模型組，最高正常組； GSH-PX活性最高是正常組，最低是模型組。見表1。

2.2血清TC,TG,腦鈣含量 模型組TG明顯高于治療1組(P<0.05)；TC治療2組明顯高于其他組。腦鈣含量治療組明顯升高。見表2。

表1 各組-SH,AchE，GSH-PX水平比較

表2 血清TC,TG,腦鈣含量比較

2.3小鼠造模前后水迷宮游水時間 造模前后水迷宮游水時間各組間無顯著差異(P>0.05),但造模后時間均縮短了；錯誤率除模型組沒有降低外,其他均顯著降低。見表3。

表3 造模前后水迷宮游水時間比較

2.4大腦皮質病理切片檢查結果 圖1可見，對照組的大腦皮質的分子層、外顆粒層、外錐體層和內顆粒光鏡層分界清楚，顆粒細胞數量和體積正常，胞質的尼氏體豐富。模型組大腦皮質分層不清楚顆粒細胞數量明顯減少，胞質的尼氏體也減少，有較多的神經元萎縮、變性和凋亡。治療組的病理改變得到很好改善，顆粒細胞數量增多，神經元胞質尼氏體也增多，其中治療2組病理改變得到改善最為明顯。

圖1 各組大鼠大腦皮質病理學觀察(HE，×200)

3 討 論

在AD的病因學中和發病機制中，膽堿能損傷學說是目前較為公認的，老年癡呆癥大腦的膽堿能學說發生嚴重的潰變，引起老年性學習記憶減退和認知障礙，產生癡呆癥狀。正常基底前腦的膽堿能神經元(主要位于基底核、斜角帶核和內側隔核)合成大量乙酰膽堿能投射纖維輸送到海馬和大腦皮質。乙酰膽堿被認為與學習和記憶有關。在發生AD時，基底前腦的膽堿能神經元丟失，造成乙酰膽堿的合成、儲存、釋放減少，從而導致以記憶和識別功能障礙為主的多種臨床表現，同時測定AchE活性降低〔1〕，額葉、頂葉皮質中膽堿含量也會明顯降低。

自由基損傷學說也是AD的病因學和發病機制的重要學說。自由基是外層軌道具有不配對電子的原子、分子式基團，具有化學活性強、連鎖反應的特點。正常情況下，人體氧代謝過程中產生低濃度生理范圍的自由基，但若產生過多或清除能力減弱，就會對機體造成傷害。自由基損傷生物膜會造成細胞內環境紊亂，導致細胞老化、死亡。自由基損傷脂類產生過氧化，過氧化脂質分解時可產生丙二醛等醛類，與磷酸、蛋白結合形成脂褐素，沉積于腦導致智力障礙。

本實驗AD模型組小鼠大腦AchE活性明顯降低。正常組、治療1組、治療2組AchE酶活性明顯高于模型組，其中復方首烏治療2組更接近正常組，效果更明顯。研究表明〔5〕，大腦學習記憶能力與膽堿能神經系統有密切關系，乙酰膽堿是此系統重要的神經遞質，它由乙酰膽堿轉移酶(CAT)催化合成，釋放后作用于M-受體，發揮生理功能后，又被AchE催化分解成膽堿和乙酸，保持一種動態平衡，是認知功能得以正常發揮。AD患者腦組織中，由于神經細胞功能減退、酶活力及記憶力、認知能力減退，其機制仍不十分清楚。目前在病理形態方面發現患者大腦中存在的老年斑和神經纖維纏結，是研究的熱點。老年斑中存在大量不溶性的β淀粉折疊蛋白，是由于可溶性的α螺旋空間構象轉變成不溶性β-折疊構象，這是一種機制不十分明了的空間構象的轉變的形式。另一方面是神經纖維變性、纏結，機理也不明了。本實驗結果表明，模型組在D-半乳糖和亞硝酸鈉聯合作用下，AchE活力明顯降低，病理形態學也發生一定的改變,與文獻報道一致〔6〕。而用復方首烏治療2組，TchE活力恢復較好，接近正常組，已有研究表明，何首烏含二苯乙烯，是其有效成分之一，對AD有較好的治療作用〔7〕。治療1組用海爾福口服液，其功能是排毒作用，并有較好的自由基清除能力，因而也有一定的恢復酶活力。

腦組織GSH-PX活力，模型組明顯低于正常組和復方首烏口服液治療2組。GSH-PX是催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成水(H2O)H和氧化型谷胱甘肽(G-S-S-G)的酶類，從而清除代謝過程中產的H2O2，是機體清除活性氧(包括 ·OH和H2O2等)的主要抗氧化酶類，對機體具有保護作用。本實驗表明其抗氧化功能提高，對大腦功能也有保護作用，治1組用海爾福口服液治療后，GSH-PX活力也有一定的提高，同時本組-SH含量也明顯高于其他各組，-SH是機體抗氧化功能的重要成分，對機體也有保護作用。總的說明治療組均有較強的抗氧化功能，對大腦保護較好。

在AD的神經細胞中，磷酸戊糖途徑被激活，大量產生NADPH，促進GSH和自由硫基產生，這些分子都是細胞對抗氧化的關鍵。另外，一些抗氧化蛋白，如SOD、過氧化氫酶、GSH-PX等在病人海馬中有所升高，以利于自由基的清除。

鈣代謝自體平衡失調與腦老化或老年癡呆的關系，近年來已引起廣泛的關注〔1〕。許多研究表明，細胞內Ca2+濃度過高會使鈣依賴性生理生化反應超常運轉、耗竭ATP、產生自由基，甚至引起細胞死亡。對AD的研究發現，在會有神經元纖維纏結(NFT)的細胞可見到Ca+的堆積。其堆積可能有幾個途徑，一是外源性Ca2+的內流增加，在神經遞質合成、釋放異常情況下，引起鈣通道開放，胞外的Ca2+大量進入細胞；另一原因可能是內源性Ca2+釋放增加，細胞器內儲存有大量的鈣，稱鈣庫，大量釋放到胞質。

4 參考文獻

1常 艷,薛毅攏.阿爾茨海默病的發病機制及其研究進展〔J〕.中國臨床康復，2004；8(4)：693-5.

2張寶弟，郭 雄.鋁致阿爾茨海默病的分子機制〔J〕.國外醫學·地理分冊，2003；24(1)：16-8.

3陳 莉，劉小艷，黃日越，等.烏圓補血口服液對D-半乳糖和亞硝酸鈉所致癡呆癥模型小鼠生化指標的影響〔J〕.中國老年學雜志，2009；29(10):1206-8.

4張樹球,黃秋艷,李朝敢，等.用Y型水迷宮測定鋅與海爾福口服液對鉛染毒所致小鼠記憶障礙的改善作用〔J〕.中國冶金工業醫學雜志,2006；23(5):546-8.

5官 斌，李玉梅，馬 駿，等.不同工藝制品的補腎中藥對癡呆小鼠乙酰膽堿酯酶活性和M-受體功能的影響〔J〕.標記免疫分析與臨床，1997；4(3):152-6.

6李 海,玉 瑩,楊彩梅，等.鋁致小鼠大腦形態與功能的變化及中藥治療〔J〕.中國工業醫學雜志,2011；24(1):40-2.

7劉汝臣.鋁中毒與Alzheimr病及其治療藥物〔J〕.山東醫藥工業，2004；26(11)：498-9.