老年大鼠脊髓腰骶段NADPH-d陽性體的表達及睪酮對其影響

徐彥楠 周晨明 張國梁 車 靜 石葛明

(河北醫科大學細胞生物教研室，河北 石家莊 050017)

脊髓腰骶段主要控制大腸、盆底肌和生殖器官的功能〔1〕。在衰老的過程中，脊髓腰骶段呈現與年齡相關的衰老性變化，同時也出現腸、膀胱和生殖器官等盆腔臟器的器質性和功能性改變。一氧化氮(NO) 是一種重要的神經信息物質，在外周和中樞神經系統中起著重要的信號轉導作用〔2〕。有研究顯示盆腔臟器的功能或器質異常可能與老年脊髓腰骶段的NO表達改變有關〔3〕。在衰老的過程中脊髓腰骶段的出現NO表達變化，特別是還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷磷酸黃遞酶(NADPH-d)陽性體的表達改變〔3〕。機體衰老體內性激素減少，NO特別是NADPH-d陽性體的表達變化是否與體內性激素的減少有關目前尚無定論。本實驗擬NADPH-d組織化學法，觀察老年大鼠脊髓腰骶段NADPH-d陽性體的表達及鼻腔給予睪酮后對其的影響。

1 材料與方法

1.1實驗分組和動物模型 選取6月齡和21月齡健康雄性Wistar大鼠15只，由河北醫科大學動物實驗中心提供。大鼠分為6月齡組、21月齡組和21月齡滴鼻組，每月齡組5只。6月齡組和21月齡組鼻腔給予芝麻油(2 mg/kg)，21月齡滴鼻組鼻腔給予睪酮(2 mg/kg)，連續給藥3個月(6月齡組從3月齡時開始給藥，21月齡組和21月齡滴鼻組從18月齡開始給藥)。

1.2灌注切片 所有大鼠經10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，經左心室灌注固定，取出脊髓后固定4 h(4℃)。取脊髓腰骶段(L6-S1)后置入30%的蔗糖中過夜。在恒冷切片機上進行連續切片，片厚40 μm。

1.3染色 將切片在0.1 mol/L PB緩沖液漂洗兩次后。浸入孵育液(孵育液組成：0.3%Triton X-100，1.0 mmol/L β-NADPH，0.2 mmol/L NBT)置于37℃ 90～120 min，緩沖液終止反應，裱片制片。在顯微鏡下觀察計數6月齡組、21月齡組和21月齡滴鼻組分布在后角淺層(SDH)、利紹爾束(LT) 、中間外側核(ILN) 、DCN和中央管(CC)NADPH-d陽性體的數目。

2 結 果

顯微鏡下，在NADPH-d染色的方法顯色的脊髓腰骶段可以看到被染成藍色的NOS神經元，細胞呈高爾基樣，其胞體和突起清晰可見。并且在21月齡組以及21月齡給滴鼻組均可見高密度球形或不規則形的NADPH-d陽性體。見圖1。6月齡組雄性Wistar大鼠脊髓腰骶段未出現NADPH-d陽性體21月齡組老年大鼠脊髓腰骶段出現較多的NADPH-d陽性體，老年大鼠鼻腔給予睪酮后此陽性體數目減少(圖1，表1)。而與21月齡組相比，21月齡滴鼻組SDH、LT、ILN、DCN和CC分別減少19%、26%、42%、31%、27%，21月齡滴鼻組與21月齡組差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組NADPH-d染色結果(Bar=100 μm)

表1 21月齡組和21月齡滴鼻組NADPH-d陽性體數目

3 討 論

本文提示大鼠在衰老過程中NADPH-d陽性體逐漸增多，而睪酮可能能夠抑制它的增多。

SDH(Ⅰ層和Ⅱ層)及DCN和ILN分別是內臟傷害性信息向中樞傳遞以及中樞對外周傷害性信息進行神經調控的主要部位〔4〕。腰骶髓DCN和ILN是位于脊髓的重要核團,它們參與盆腔內臟傷害性信息的傳遞〔5〕。脊髓腰骶段與腸、膀胱和生殖器官功能障礙聯系密切〔7〕。NO是由一氧化氮合酶(NOS)合成，是一種重要的神經遞質在外周和中樞神經系統中起著重要的信號轉導作用〔2〕。NADPH-d的分布與的NOS分布基本一致，所以可以用NADPH-d 組化技術對中樞神經系統中的NOS進行定位和定量分析。分布在脊髓的大量的NADPH-d陽性神經元參與內臟的調節〔7〕。有研究報道老年大鼠脊髓腰骶部的NADPH-d陽性體數量和分布較成年大鼠增多，并集中在脊髓腰骶部背側部如：SDH、LT、ILN、DCN、CC等〔3〕，與本研究結果相同。老年大鼠盆腔內臟功能減弱，可能與脊髓腰骶部NADPH-d陽性體的出現有關〔3〕。在衰老的過程中，大鼠的性激素水平逐漸降低。本文顯示老年大鼠鼻腔給予睪酮后NADPH-d陽性體數目明顯減少，說明睪酮可能抑制了NADPH-d陽性體增多。所以給予睪酮可能會對盆腔內臟的功能起到改善作用。

綜上，由NADPH-d陽性體導致的老年人盆腔臟器功能障礙可能與體內性激素水平降低有關，其機制有待進一步研究。

4 參考文獻

1Berkley KJ，Hubscher CH，Wall PD.Neuronal responses to stimulation of the cervix，uterus，colon，and skin in the rat spinal cord〔J〕.J Neurophysiol,1993;69(2)：545-56.

2Schuman EM,Madison DV.Nitric oxide and synaptic function〔J〕.Ann Rev Neurosci,1994;17:153-83.

3Tan HB,He JW,Wang SY,etal.Age-related NADPH-diaphorase positive bodies in the lumbosacral spinal cord of age rats〔J〕.Arch Histol Cytol,2006；69(5):297-310.

4季 偉,裴力雨,史 娟，等.5-羥色胺在大鼠腰骶髓后連合核和中間帶外側核參與盆腔內臟炎性調控的形態學研究〔J〕.神經解剖學雜志，2006；(3)：333-6.

5Ding YQ，Zheng HX，Gong LW.Direct projections from the lumbosacral spinal cord to Barrington′s nucleus in the rat：a special reference to micturition reflex〔J〕.J Comp Neurol，1997;389：149-60.

6Berkley KJ.A life of pelvic pain〔J〕.Physiol Behav，2005;86(3)：272-80.

7Doone VG，Pelissier N，Manchester T,etal.Distribution of NADPH-d and nNOS-IR in the thoracolumbar and sacrococcygeal spinal cord of the guinea pig〔J〕.Auton Nerv Syst，1999;77：98-113.